西藏自治區牦牛出血性敗血癥的診治

邊巴 德吉

（1.西藏林芝市朗縣農業農村局畜牧獸醫防疫站，西藏 林芝 860000；2.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009）

牛出血性敗血癥又簡稱牛出敗，是由多殺性巴氏桿菌感染引發牛出現以呼吸道癥狀和組織器官出血癥狀為主的急性、熱性傳染病，急性發病病程較短，常引起患牛死亡，群體中一旦有動物感染，則可威脅到同群其他動物［1］。多殺性巴氏桿菌可感染多種家畜，對于幼畜更易感染，幼畜感染后死亡率高于成年動物。近年來，關于牛出血性敗血癥的研究報道仍舊較多，結合現有資料表明，牛出敗已經對我國牛產業發展造成一定威脅［2］。

本病例中發病牦牛經臨床和實驗室診斷，確診為多殺性巴氏桿菌感染，根據本試驗藥敏結果用藥以及對假定健康群體進行疫苗免疫后，疫情風險一周內得以消除。通過本研究的開展，能夠為西藏地區牦牛牛出敗的防治提供寶貴參考，同時能夠引起養殖戶對于牛出血性敗血癥的重視。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

西藏自治區某牧民家中死亡牦牛肺臟和肝臟。

1.2 儀器設備及試劑

5%綿羊鮮血瓊脂培養基、MH（A）培養基購自青島海博生物有限公司；生化鑒定管、藥敏片購自杭州微生物試劑公司；分子生物學試劑購自迪寧生物；電熱恒溫培養箱購自上海精宏儀器廠；引物合成和測序由上海生工完成。

1.3 細菌培養

于實驗室內使用接種環將病料接種于血瓊脂平板，置于電熱恒溫培養箱中36±1℃培養24 h，挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢，而后挑取單菌落再次接種于血瓊脂平板同樣條件進行培養。

1.4 生化鑒定

挑取純化培養物接種于生化鑒定管中，于電熱恒溫培養箱中36±1℃培養24 h～48 h觀察記錄結果。

1.5 16S rRNA基因PCR擴增及測序

挑取從死亡牛4 份肺臟和4 份肝臟病料中獲得的8 株分離菌菌落，添加于無菌蒸餾水中，100 ℃加熱10 min 后，12000 rpm 離心2 min 獲得DNA。PCR 擴增引物為27F:5′— AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3′和

1492R：5′— TACGGC TACCTTGTTACGACTT — 3′，目的條帶大小為1300 bp。反應體系為20μL，反應程序為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，共30 個循環；72℃10min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將PCR擴增產物送至上海生工測序。

1.6 動物致病性試驗

將27 只小鼠隨機分為9 組（n=3），實驗組8 組，對照組1組。實驗組分別以8株分離株的108cfu/mL 生理鹽水菌液0.2mL 腹腔注射小鼠，對照組使用無菌生理鹽水0.2mL腹腔注射小鼠，觀察記錄小鼠注射后變化。

1.7 藥物敏感性試驗

將新鮮菌液濃度調整至麥氏值0.5，均勻涂布于MH（A）瓊脂，使用紙片法進行藥敏試驗，參照紙片法藥敏判定標準判定結果。

2 試驗結果

2.1 細菌分離培養

肺臟和肝臟病料接種培養24h 后，血瓊脂平板表面均可見針尖樣大小、露珠狀、邊緣整齊、透明的菌落。革蘭氏染色為陰性菌，菌體呈短球桿狀（圖1），菌落形態結合染色鏡檢結果，初步懷疑為多殺性巴氏桿菌。

圖1 革蘭氏染色鏡檢10mm×100mm

2.2 生化鑒定

生化鑒定試驗結果表明，8 株分離株蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇和觸酶試驗為陽性，乳糖、吲哚、M.R和V.P 試驗為陰性。生化鑒定結果與《伯杰氏細菌手冊》對比發現，分離株與多殺性巴氏桿菌生化反應較為一致。

2.3 16S rRNA基因PCR和測序

PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，分離株均擴增到約1300 bp 的目的條帶（圖2）。擴增產物測序結果登錄NCBI網站比對，結果表明8株分離株均與多殺性巴氏桿菌序列相似性達90%，確定所分離細菌為多殺性巴氏桿菌。

圖2 PCR擴增產物電泳圖

2.4 小鼠致病性試驗

實驗組小鼠均于48 h 內死亡，死亡小鼠可見出血性肺炎、肝臟腫大、腸道充血。于死亡小鼠的肺臟和肝臟均再次分離到多殺性巴氏桿菌，證實所分離的多殺性巴氏桿菌菌株能夠引起小鼠病變，由此推測多殺性巴氏桿菌可能為本次引發牦牛感染死亡的病原菌。

2.5 藥物敏感性試驗

根據紙片擴散法藥敏實驗標準，測量抑菌環直徑后得到以下結果（表1）。

表1 藥物敏感性試驗結果

3 分析與討論

多殺性巴氏桿菌對多種動物均可造成威脅［3］，同群中有感染發病動物時，即可成為傳染源，家畜中以豬牛羊發病較多。通常認為，牛出血性敗血癥的主要傳染源是病牛［4］，病牛繼續通過分泌物和排泄物排出病原體，造成環境、水、飼料和用具受到污染，造成進一步傳播，也可通過呼吸道飛沫和吸血昆蟲傳播［5］。該病沒有明顯的季節性，但與熱、冷、熱、濕和雨季交替、擁擠、通風不良、飼料突變、過度疲勞、長途運輸、寄生蟲感染等因素造成應激或抵抗力下降時，病原體可能利用它引起疾病［6-7］。

本研究中，由現場調查、臨床癥狀觀察和實驗室診斷，最終確定該農戶家中牦牛死亡是由于多殺性巴氏桿菌感染引起。在實驗室診斷過程中，及時建議養殖戶進行病牛隔離治療的同時加強消毒和緊急接種，最終疫情得到有效控制。通過本試驗的進行，能夠為牛出敗的防治和科學研究提供一定參考。