醫院內感染中銅綠假單胞菌與秀麗隱桿線蟲互作模型的運用研究＊

文/鄒偉，張新樂，鄧文航，白自桐，陳玉婷

病原細菌對現有抗生素的耐藥性不斷增強是公共衛生管理的一大障礙，其中醫院感染的病原菌中，銅綠假單胞菌占57%。大醫院疾病患者中，囊性纖維化患者以及燒傷引起免疫低下患者更易感染銅綠假單胞[1]，對人體健康危害極大，治療困難、代價高。多數抗生素作用于細胞生長的過程發揮殺菌功能，然而在治療的過程中，病原菌發生基因突變表現出適應對抗生素的耐受性，逐漸適應抗生素，導致抗生素耐藥菌株的產生，從而加劇治療難度[2]。因此，尋找替代傳統抗生素治療的方法應對細菌耐藥性迫在眉睫。在許多耐藥細菌物種中，各種毒力因子的產生和群體感應（QS）細胞間通信機制調控密切相關。QS調節系統使細菌群體能發起對宿主免疫的防御反應，保護自身免受抗感染藥物等殺滅[3]。靶向作用于QS系統克服了耐藥性問題，因此篩選作用于QS系統的藥物是抗銅綠假單胞菌藥物篩選的新方向。此外，在學習記憶機制研究中也取得較好進展，通過該模型研究秀麗隱桿線蟲的記憶、遺忘等行為參與的神經元及調控機制也逐漸受到關注。

1 靶點作用于群體感應系統藥物篩選

細菌群體感應（QS）是指細菌利用營養物質促進群體生長繁殖使群體數量和密度快速增加，從而表現出與個體生理反應不一致的群體行為。其調控的具體機制為群體數量和密度增加后，伴隨著信號分子的濃度也增加，進而將信號傳遞給受體蛋白進一步傳遞胞內，正調控（激活）或者負調控（抑制）特定基因的表達，達到調控微生物群體生理變化的目的。機會性致病病原體的QS調控系統包含3種不同類型，分別是las、rhl和pqs系統，調控病原體致病因子的產生[3]，因此是開發新型抗菌藥物的重要靶點。根據群體感應原理存在一些干擾其運行的機制，主要有三類方法。第一類干擾方法是分解群體感應系統中的信號分子，內酯酶可水解ahl的內酯鍵，生成酰基高絲氨酸生物活性大大降低從而不能與受體蛋白結合，破壞細菌的Qs體系；第二類干擾方法是抑制Al的生成，切斷Qs信號通路；第三類干擾方法是通過合成AI的結構類似物，與相應的受體蛋白競爭性結合，破壞信號通路的傳遞。植物源五環三萜、樺木脂素和樺木脂酸具有廣泛的生物活性，是治療銅綠假單胞菌感染的有效物質，該化合物主要存在于樺木科植物、昆欄樹樹皮和酸棗種子中。樺木脂具有廣泛的藥理特性，包括抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和肝臟保護活性[4]。此外，該化合物通過降低胞外多糖的產生等特性抑制生物膜形成，作為QS系統受體、lasR和rhlr的強競爭性抑制劑，成為潛在的抗感染藥物，用于控制銅綠假單胞菌的慢性感染[5]。

2 在銅綠假單胞菌毒力和耐藥性研究中的運用

該模型用于篩選敏感藥物的及抗菌機制，為聯合用藥提供了證據，有助于抗侵染化合物如四環素、利福平和多粘菌素B的篩選[6]。此外在銅綠假單胞菌侵染時，某些化合物能夠增強線蟲的先天免疫，如：陸生植物、內生真菌、海洋細菌和海藻的天然產物[7]。越來越多的植物提取化合物在抗病原菌感染中有效，主要作用機制是提高宿主免疫或者降低病原毒力。如對丁香花蕾抗銅綠假單胞菌活性的研究中發現，該活性物質可顯著增強線蟲免疫而抵抗病原菌侵染，可作為治療耐藥病原菌感染的潛在治療活性物[8]。五環三萜類化合物通過降低胞外多糖的產生顯著干擾生物膜發育的初始階段，增加秀麗隱桿線蟲的存活率[5]。此外，二甲雙胍可以增強被侵染線蟲先天免疫，從宿主的層面增強自身抵抗力產生對病原菌的高抵抗力。因此，二甲雙胍可用于病原體侵染治療[9]。雖然使用互作模型發現了一些治療疾病的新化合物，探索了部分有效化合物的活性機制，但銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲產生的耐藥機制研究仍不足，是今后研究的重要方向。

3 在病原菌學習機制研究中的運用

以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，研究其對病原菌的記憶和遺忘機制得到廣泛運用，線蟲被病原細菌侵染后會產生記憶[10]。在NGM平板的兩端分別加入線蟲OP50食物和銅綠假單胞菌PA14，將線蟲加至兩種菌體的中間，更多的線蟲爬至PA14菌斑中，表現出對PA14的喜愛[11]。干擾AWB和AWC神經元相應神經肽和受體基因表達，線蟲對PA14偏好異常，表明AWB和AWC神經參與線蟲對PA14氣味偏好行為調控[12]。此外，線蟲的PA14的偏好行為在外界的干擾下會發生反轉，將同步化后生長至young adult的線蟲放入涂滿PA14菌斑中（確保線蟲無法逃離菌斑）4 h后，進行偏好實驗，當其再次嗅到PA14氣味，表現出厭惡行為（更偏好于OP50）[10]。研究發現該行為的改變屬于線蟲對病原細菌的學習行為，PA14進入線蟲體內并寄生繁殖破壞腸道，線蟲感受傷害從而產生記憶，再次感知PA14氣味后表現出逃避反應。該學習行為是由ADF神經元中的五羥色胺調控的。當線蟲暴被PA14侵染后，神經系統做出反應，五羥色胺在ADF神經元中合成增加，釋放后特異性的與AIZ和AIY中間神經元受體MOD-1結合，通過激活其他信號通路產生對病原菌的學習[11]（見圖1）。

圖1 秀麗隱桿線蟲對病原菌記憶學習調控模式圖

4 展望

在篩選銅綠假單胞菌敏感藥物過程中，秀麗隱桿線蟲侵染模型運用廣泛，此外該模型還可用于協同藥物篩選驗證及作用機制研究，為聯合用藥提供證據。近年來分離到多種在侵染期間提高免疫免受侵染的化合物，發現治療銅綠假單胞菌引起的慢性炎癥疾病新靶點。雖然該模型得到了廣泛運用，但許多銅綠假單胞菌侵染線蟲模型背后的毒力機制仍然不是十分清晰，有待繼續探索。此外線蟲具有完整的神經元結構，神經元間可以實現信號傳遞，很多保守調控通路與哺乳動物同源，是研究學習、記憶和遺忘的較好模式生物。近年來，在學習和記憶方面的研究取得較多進展，但在病原遺忘行為的研究中鮮有報道。因此，病原遺忘的研究也是今后較好的選題。