TINCR靶向microR-544a/FBXW7對人乳腺癌細胞增殖、侵襲的影響*

江國斌，陳曉萍

（臺州醫院 乳腺甲狀腺外科，浙江 臺州318050）

乳腺癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，是女性死亡的首要原因[1]。據全球癌癥報告統計，2016年全球約25萬人確診為乳腺癌，占女性惡性腫瘤新發病例的29%左右[2]。近年來，乳腺癌在我國的發病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化，對我國女性生命安全造成嚴重威脅[3]。因此，探究乳腺癌的發生、發展機制，尋找新治療靶點具有潛在價值。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）屬于非編碼RNA，長度＞200個核苷酸，與乳腺癌等多種腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。組織分化誘導非蛋白編碼RNA（tissue differentiation inducing non-protein coding RNA,TINCR）屬于非典型lncRNA，是體細胞組織分化及腫瘤發生、發展所需的關鍵lncRNA[6]。microRNA-544a（miR-544a）在腫瘤侵襲、轉移中發揮重要作用[7]。F-box/FBXW7是一種經典的抑癌基因，介導多種重要癌蛋白的泛素化降解，其基因表達缺失會導致原癌基因激活[8]。目前，lncRNA TINCR對乳腺癌的影響尚缺少研究。本實驗通過研究過表達lncRNA TINCR靶向miR-544a/FBXW7對人乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲等生物學行為的影響，為尋找乳腺癌新治療新靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑人乳腺癌MCF7細胞株、胎牛血清、DMEM培養基、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、FBXW7抗體、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）抗體、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）抗體、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）抗體、β-actin抗體（貨號：SCC-111011-1、S9030、90113、BC3640、PT0001、K004271P、K000323P、K001437M、K001435M、M1000170）購自上海恒斐生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉染試劑（貨號：11668030）購自美國Life Technologies公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）試劑盒（貨號：DEM202-50T）購自北京拜爾迪生物技術有限公司，CCK-8試劑、Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒、羊抗兔IgG抗體（貨號：QN1293-OIR、WK304、BTN131149）購自北京百奧萊博科技有限公司，MatrigelTM基質膠（貨號：354234）購自廣州威佳科技有限公司，pcDNA3.1空載體、化學發光試劑盒（貨號：ZY790-20、ZY-11256）購自上海澤葉生物科技有限公司，TINCR、miR-544a、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2 主要儀器恒溫培養箱（型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC）購自日本松下公司，全自動酶標儀（型號：ELX800）購自美國BIO-TEK公司，流式細胞儀（型號：BD FACSCantoⅡ）購自美國BD公司，顯微鏡（型號：CX31）購自日本OLYMPUS公司，化學發光成像系統（型號：ChemiDocXRS）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養與分組

1.2.1 細胞培養將人乳腺癌MCF7細胞株（上海恒斐生物科技有限公司）放置于37℃、5% CO2培養箱內，在含10%胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素各100 u/ml）DMEM培養基中培養，當細胞融合至80%左右時，胰酶消化、傳代。

1.2.2 細胞分組取對數期MCF7細胞，按1×105個/ml接種于96孔培養板，于37℃、5%CO2培養箱內培養。使用Lipofectamine 2000轉染試劑將pcDNA3.1-TINCR表達載體、pcDNA3.1空載體分別轉入到MCF7細胞，分別作為TINCR上調組和TINCR NC組，將未轉染的MCF7細胞作為空白對照組。轉染24 h后正常培養，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3 qRT-PCR檢測MCF7細胞TINCR、miR-544a相對表達量

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調組MCF7細胞培養24 h后提取總RNA，逆轉錄成cDNA，β-actin為內參基因。反應條件：95℃預變性15 min；95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸40 s，共計45個循環；72℃繼續延伸10 min。以2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 CCK-8法檢測MCF7細胞增殖情況

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調組MCF7細胞培養48 h，加入CCK-8試劑，培養2 h。采用全自動酶標儀檢測450 nm處的光密度值（optical density,OD）。

1.5 流式細胞術檢測MCF7細胞凋亡情況

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調組MCF7細胞培養48 h，PBS洗滌后使用400 μl 1×結合緩沖液制備細胞懸浮液，并調整細胞濃度為1×106個/ml，加入5 μl Annexin V-FITC；15 min后加入10 μl PI孵育1 h，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.6 Transwell法檢測MCF7細胞侵襲情況

使用50 μl Matrigel基質膠（1∶8稀釋）鋪Transwell小室的微孔膜，用無血清培養液將空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調組MCF7細胞稀釋至2.5×105個/ml，在Transwell小室上層加200 μl，下室加500 μl含10%胎牛血清的培養液，37℃、5% CO2條件下孵育24 h，擦去膜上細胞，用4%多聚甲醛固定已經穿膜并黏附在微孔膜外表面的細胞10 min，PBS洗滌，0.5%結晶紫染色20 min。在200倍鏡的顯微鏡下隨機選取6個視野，統計穿膜細胞數，并計算平均值。

1.7 Western blotting檢測MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對表達量

空白對照組、TINCR NC組及TINCR上調組MCF7細胞培養48 h，收集細胞，提取各組細胞總蛋白并定量。電泳分離、轉膜、封閉，加FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2、β-actin抗體（1∶500）孵育過夜，TBST洗滌，加羊抗兔IgG二抗（1∶1 000，辣根過氧化物酶標記）室溫孵育1 h，發光法顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.8 回復實驗

取TINCR上調組MCF7細胞，按1×105個/ml的密度接種于96孔培養板，于37℃、5% CO2培養箱內培養。使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別將miR-544a NC、miR-544a mimic轉入MCF7細胞，其分別作為miR-544a NC組和miR-544a上調組。轉染24 h后正常培養，qRT-PCR檢測miR-544a相對表達量驗證轉染效率，CCK-8法檢測MCF7細胞增殖，Transwell法檢測MCF7細胞侵襲，Western blotting檢測MCF7細胞FBXW7蛋白相對表達量，具體步驟參照1.3、1.4、1.6和1.7。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調組MCF7細胞lncRNA TINCR相對表達量升高（P＜0.05），miR-544a相對表達量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量比較（±s）

表2 各組MCF7細胞lncRNA TINCR、miR-544a相對表達量比較（±s）

注：?與TINCR上調組比較，P＜0.05。

組別miR-544a lncRNA TINCR空白對照組TINCR NC組TINCR上調組F值P值1.04±0.25?0.99±0.24?0.52±0.16 10.167 0.002 1.02±0.28?1.05±0.33?1.84±0.42 10.702 0.001

2.2 各組MCF7細胞增殖情況

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調組MCF7細胞OD值分別為（0.69±0.18）、（0.78±0.22）和（0.35±0.09），經方差分析，差異有統計學意義（F=10.414，P=0.001）。進一步兩兩比較結果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調組MCF7細胞OD值降低（P＜0.05）。

2.3 各組MCF7細胞凋亡情況

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調組MCF7細胞凋亡率分別為（11.17±2.04）%、（10.65±1.88）%和（46.82±8.79）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=91.083，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調組MCF7細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組MCF7細胞流式細胞圖

2.4 各組MCF7細胞侵襲情況

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調組MCF7細胞穿膜細胞數分別為（224.25±28.65）個、（206.76±23.92）個和（146.92±17.55）個，經方差分析，差異有統計學意義（F=17.402，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調組MCF7細胞穿膜細胞數降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調組MCF7細胞侵襲情況（×100）

2.5 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對表達量

空白對照組、TINCR NC組、TINCR上調組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：空白對照組與TINCR NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調組MCF7細胞FBXW7、Bax蛋白相對表達量升高（P＜0.05），PCNA、MMP-2蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對比表達量比較（±s）

表3 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白相對比表達量比較（±s）

注：?與TINCR上調組比較，P＜0.05。

組別MMP-2蛋白PCNA蛋白Bax蛋白FBXW7蛋白空白對照組TINCR NC組TINCR上調組F值P值0.92±0.25?0.97±0.26?0.29±0.06 19.337 0.000 0.89±0.26?0.84±0.22?0.33±0.08 14.123 0.000 0.47±0.11?0.38±0.10?0.93±0.27 16.491 0.000 0.52±0.12?0.55±0.15?0.86±0.23 7.102 0.007

圖3 各組MCF7細胞FBXW7、PCNA、Bax、MMP-2蛋白的表達

2.6 lncRNA TINCR通過靶向miR-544a影響MCF7細胞增殖、侵襲及FBXW7蛋白的表達

TINCR上調組、miR-544a NC組、miR-544a上調組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數及miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：TINCR上調組與miR-544a NC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與TINCR上調組和miR-544a NC組比較，miR-544a上調組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數及miR-544a相對表達量升高（P＜0.05），FBXW7蛋白相對表達量降低（P＜0.05），見表4和圖4、5。

表4 各組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數及miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組MCF7細胞OD值、侵襲細胞數及miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量比較（±s）

注：?與TINCR上調組比較，P＜0.05。

組別FBXW7蛋白OD值侵襲細胞數/個miR-544a TINCR上調組miR-544a NC組miR-544a上調組F值P值0.83±0.08?0.79±0.08?0.43±0.07 49.356 0.000 0.34±0.07?0.36±0.07?0.62±0.08 27.111 0.000 160.66±15.27?153.84±15.83?212.93±18.40 22.875 0.000 1.01±0.09?1.02±0.08?1.85±0.10 170.767 0.000

圖4 TINCR上調組、miR-544a NC組、miR-544a上調組MCF7細胞侵襲情況（×100）

圖5 各組MCF7細胞FBXW7蛋白的表達

3 討論

乳腺癌在女性腫瘤中排行第1位，具有發病率高、惡性程度高、易產生耐藥性及預后差等特點[9]。臨床上治療乳腺癌多采用手術、放射治療，但容易引起并發癥，影響患者生存質量[10]。目前乳腺癌發病機制尚未統一，臨床上缺少治療該病的有效靶向手段。但近年來，越來越多的研究表明乳腺癌的發生、發展與癌細胞增殖、侵襲能力有關[11]。

lncRNA是一類長度＞200個核苷酸的RNA，不具有開放閱讀框及蛋白質編碼功能[12]。近年來研究發現，lncRNA廣泛參與機體各種生理病理過程，并作為抑癌或致癌基因在癌細胞增殖、遷移過程中發揮調節作用[13-14]。lncRNA TINCR在人類分化成熟的皮膚組織中異常表達，且lncRNA TINCR可作為致癌基因或抑癌基因，參與多種腫瘤的增殖、侵襲等過程。ZHANG等[15]研究發現，lncRNA TINCR是潛在的致癌基因，上調其表達對食管鱗狀癌細胞增殖、遷移、侵襲過程具有促進作用。HU等[16]研究發現，lncRNA TINCR高表達可促進肝癌細胞的浸潤和轉移。ZHANG等[17]研究發現，TINCR是潛在的抑癌基因，下調其表達對結直腸癌細胞增殖、轉移過程具有促進作用。但TINCR在乳腺癌中發揮的作用尚不清楚。

LIU等[18]研究表明，lncRNA TINCR是一種相互競爭的內源性RNA，可通過miR-544a將其從靶基因FBXW7中分離出來，其在肺癌中發揮抑制增殖、侵襲的作用。有研究發現，過表達miR-544a能促進乳腺癌細胞發生遷移和侵襲。FBXW7在許多癌癥中發揮抑癌作用[19]。GAO等[20]研究發現，腫瘤抑制因子FBXW7可以通過促進MTDH蛋白水解來抑制乳腺癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。而本研究中上調TINCR表達后，發現MCF7細胞OD值、穿膜細胞數降低，凋亡率升高，提示lncRNA TINCR對乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲過程具有抑制作用，且TINCR可誘導MCF7細胞凋亡。為探究TINCR對MCF7細胞的影響是否與miR-544a、FBXW7有關，本研究進一步檢測miR-544a、FBXW7蛋白相對表達量。結果表明，上調TINCR表達后，MCF7細胞miR-544a相對表達量降低，FBXW7蛋白相對表達量升高，而在上調TINCR的同時上調miR-544a表達后，FBXW7蛋白相對表達量降低，同時細胞OD值、侵襲細胞數升高，提示過表達lncRNA TINCR可能是通過抑制乳腺癌MCF7細胞miR-544a表達，進而促進FBXW7表達，發揮對乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲的抑制作用，以及對凋亡的促進作用。進一步推測，TINCR影響MCF7細胞的機制與在肺癌類似[18]，可能通過抑制miR-544a與FBXW7結合，發揮FBXW7對乳腺癌MCF7細胞的抑制增殖、侵襲及促進細胞凋亡作用。

PCNA、Bax、MMP-2分別為參與細胞增殖、凋亡、侵襲過程的常見蛋白，在乳腺癌細胞中亦發揮作用[21-23]。本研究結果表明，與空白對照組和TINCR NC組相比，TINCR上調組MCF7細胞PCNA、MMP-2蛋白相對表達量降低，Bax蛋白相對表達量升高，提示過表達lncRNA TINCR可抑制乳腺癌MCF7細胞PCNA、MMP-2表達，并促進Bax表達，從而抑制乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲，誘導凋亡，推測lncRNA TINCR靶向miR-544a/FBXW7抑制乳腺癌MCF7細胞增殖、侵襲及促進凋亡過程可能是通過調控PCNA、Bax、MMP-2表達來實現的。

綜上所述，lncRNA TINCR可能通過靶向miR-544a/FBXW7，抑制人乳腺癌細胞的增殖、侵襲，并促進人乳腺癌細胞凋亡。但乳腺癌發生、發展途徑復雜，lncRNA TINCR涉及的其他細胞內信號通路及其在不同乳腺癌細胞中的作用還需進一步探究，以期更全面地評價lncRNA TINCR對乳腺癌的影響，為臨床治療乳腺癌提供新的思路。