利用白消安致BALB/c小鼠生殖毒性建立NOA疾病模型

李慧赟 王慧芳 孟曉麗 趙均 宋春英 郭興萍

不孕癥是指一年或以上時(shí)間未采取任何避孕措施，性生活正常(每周兩次及以上)而沒(méi)有成功妊娠[1]。有15%的夫婦在育齡期會(huì)發(fā)生不孕不育，其中有50%為男性不育。其中，無(wú)精子癥占男性不育原因的20%[2]，包括梗阻性無(wú)精癥(obstructive azoospermia, OA)和非梗阻性無(wú)精癥(non-obstructive azoospermia,NOA)。OA患者可以通過(guò)附睪或睪丸外科取精獲得精子，但NOA患者則失去了獲得精子的機(jī)會(huì)。2011年Takuya Sato等提出了兩種體外誘導(dǎo)精子發(fā)生的方法：一種是器官培養(yǎng)法，將新生小鼠睪丸組織撕成約1 mm3大小的組織塊，置于1.5%瓊脂糖凝膠上34℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得精子并生育后代[3]；另一種是從未成熟小鼠睪丸分離收集生殖干細(xì)胞，將其移植到受體睪丸組織，然后組織培養(yǎng)，獲得單倍體精子細(xì)胞，采用顯微受精技術(shù)獲得可育后代[4]。本研究利用白消安對(duì)雄性小鼠的生殖毒性及在體修復(fù)作用建立不同損傷程度的NOA動(dòng)物模型，為生精障礙睪丸組織器官培養(yǎng)提供穩(wěn)定的研究對(duì)象，為臨床治療NOA提供理論支持。首先，本研究通過(guò)HE染色和Johnsen法評(píng)估生精細(xì)胞損傷程度。接著，通過(guò)免疫組化法對(duì)受損嚴(yán)重組的生精小管進(jìn)一步定位，判斷損傷組織減數(shù)分裂階段，評(píng)估可供組織體外培養(yǎng)的研究時(shí)間。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c小鼠為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK-(軍)2012-0004]，使用許可證號(hào)[SYXK-(晉)2015-0001]。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周齡性成熟的BALB/c雄性小鼠，共45只，平均體重約(27±3)g。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，采用NIH、ICR、BALB/c 3個(gè)品系的小鼠在35 mg/kg白消安以上3個(gè)劑量組(35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg)獲得無(wú)精子癥模型動(dòng)物。為了更客觀的反應(yīng)白消安的劑量、時(shí)間效應(yīng)，本研究分0 mg/kg組、30 mg/kg組、40 mg/kg組，每組15只，共45只。30 mg/kg組每只小鼠單次腹腔注射30 mg/kg白消安；40 mg/kg組每只小鼠單次腹腔注射40 mg/kg白消安；0 mg/kg組每只單次腹腔注射1ml生理鹽水。

2.主要試劑：白消安(Busulfan，B2635，Sigma，美國(guó))，二甲基亞砜(DMSO，D5879，Sigma，美國(guó))，PBS(P1022，索寶來(lái)，北京)，鼠卵泡刺激素 ELISA試劑盒 (48-T，Mlbio，上海)，鼠睪酮ELISA 試劑盒(48-T，Mlbio，上海)兔抗STRA8多克隆抗體(ab49602，Abcam，英國(guó))、兔抗SCP3多克隆抗體(ab15093，Abcam，英國(guó))、兔抗TNP1多克隆抗體(ab73135,Abcam，英國(guó))等。

白消安溶液配制：取0.1 g白消安溶于10 mL DMSO溶液中，將10 mg/mL的白消安溶液分裝于1.5 mL Eppendorf離心管中4℃避光保存?zhèn)溆茫褂们坝脺缇睇}水稀釋10倍(終濃度為1 mg/mL)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.基本情況：注射白消安當(dāng)天記為第0天，于注射白消安第2、4、6、8、10周分別取3只小鼠，記錄體重、雙側(cè)睪丸濕重。

2.HE染色：睪丸組織10%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，5μm厚切片，HE染色，在200倍顯微鏡下觀察，采用 Johnsen法[6]評(píng)價(jià)精子發(fā)生障礙程度，即完好的精子發(fā)生為 10 分; 各級(jí)生精細(xì)胞存在，但排列紊亂為9分; 生精小管中有少量精子(5～10個(gè))為8分; 無(wú)精子，但有許多精子細(xì)胞為7分; 無(wú)精子，僅有少量精子細(xì)胞(5～10個(gè))為6分; 無(wú)精子， 但有許多精母細(xì)胞為5分:無(wú)精子細(xì)胞， 僅有個(gè)別精母細(xì)胞(<5個(gè)為4分);僅有精原細(xì)胞為3分;無(wú)生精細(xì)胞，僅有支持細(xì)胞為2分;管腔內(nèi)無(wú)細(xì)胞為1分。

3.免疫組化：睪丸組織10%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)步驟完成免疫組化染片，通過(guò)LeciaApplactionStiue圖像系統(tǒng)分別取三個(gè)不同位置的平均光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)服從正態(tài)檢驗(yàn)，同一時(shí)間點(diǎn)白消安處理組與對(duì)照組相比用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠基本情況

1.與0 mg/kg組相比，30 mg/kg組、40 mg/kg組小鼠在注射白消安后毛色暗淡無(wú)光，部分小鼠背部皮毛脫落明顯，耳廓及唇部皮膚顏色與0 mg/kg組相比略顯蒼白，活動(dòng)減少、慵懶狀，進(jìn)食量減少、飲水量增加。第4周時(shí)小鼠體貌特征改變最明顯，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)組小鼠仍沒(méi)有完全恢復(fù)到正常小鼠生理狀態(tài)。

2.體重與睪丸濕重：注射白消安第2周，30 mg/kg組、40 mg/kg組體重減低：40 mg/kg組體重下降趨勢(shì)大于30 mg/kg組；第6～10周兩組小鼠體重出現(xiàn)恢復(fù)，但40 mg/kg組恢復(fù)慢于30 mg/kg組。第2周后30 mg/kg組、40 mg/kg組睪丸濕重持續(xù)下降，且下降趨勢(shì)明顯，6周后睪丸濕重維持穩(wěn)定，均明顯低于0 mg/kg組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖1所示。

圖1 白消安對(duì)小鼠體重、睪丸濕重的影響Figure 1 The effect of busulfan on the body weight and wet testis weight of mice

二、HE染色

注射白消安第2周，生精小管中生精細(xì)胞出現(xiàn)斷層樣變化，第4周管腔空泡化改變，且40 mg/kg組損傷最為嚴(yán)重；第6周30 mg/kg組生精細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)，個(gè)別生精小管出現(xiàn)精原細(xì)胞，而40 mg/kg組生精小管則基本均處于完全空泡化狀態(tài)；第8～10周30 mg/kg組、40 mg/kg組極少部分生精小管出現(xiàn)精原細(xì)胞(如圖2所示)。根據(jù)Johnsen評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在200倍顯微鏡下分別對(duì)0 mg/kg組、30 mg/kg組、40 mg/kg組的50個(gè)曲細(xì)精管進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分越低生精小管損傷越嚴(yán)重，如表1所示。

表1 不同濃度白消安、不同時(shí)間點(diǎn)的Johnsen評(píng)分(n=50)Table 1 Johnsen scores of different concentrations of busulfan and different time points (n=50)

三、免疫組化

根據(jù)HE染色及Johnsen評(píng)分結(jié)果可知，40 mg/kg組損傷最嚴(yán)重且損傷持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，更適合作組織培養(yǎng)的動(dòng)物模型。對(duì)其進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，可得與0 mg/kg組相比，注射白消安4周40 mg/kg組中 STRA8、SCP3的表達(dá)最少，TNP1極少表達(dá)；6周后 STRA8、SCP3表達(dá)開(kāi)始增加，8周基本接近0 mg/kg組水平，TNP1少量表達(dá)(如圖3所示)。

圖3 40mg/kg組不同時(shí)間段STRA8、SCP3和TNP1表達(dá)情況Figure 3 Expression of STRA8, SCP3 and TNP1 in the 40mg/kg group at different time periods

討 論

無(wú)精子癥(azoospermia)是指射出的精液里沒(méi)有精子，若要得出無(wú)精子癥的診斷，精液檢測(cè)應(yīng)至少進(jìn)行3次，每次間隔1周以上，所有精液標(biāo)本離心后沉淀物中未見(jiàn)精子。NOA是曲細(xì)精管中，精子發(fā)生成熟障礙導(dǎo)致的無(wú)精子癥，占無(wú)精子癥的60%，是男性不育最嚴(yán)重的類型，主要依靠供精或保養(yǎng)獲得后代[7-8]。本研究旨在建立一種穩(wěn)定、可靠的生精功能障礙動(dòng)物模型，為器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)生精障礙睪丸組織提供穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

常用的去除睪丸生精細(xì)胞的方法包括電離輻射、熱處理、藥物、激素處理以及基因敲除等。電離輻射可以造成各級(jí)的生精細(xì)胞凋亡，間質(zhì)和支持細(xì)胞損傷，F(xiàn)SH、LH升高[9]。熱處理主要損傷初級(jí)精母細(xì)胞[10]，而激素法所制備無(wú)精子癥動(dòng)物模型耗時(shí)且不穩(wěn)定[11]。截止當(dāng)前，白消安常用來(lái)制作精原干細(xì)胞移植模型，但最佳濃度報(bào)道不一[12-13]。有研究報(bào)道，3個(gè)品系小鼠(NIH、ICR、BALB/c)在35 mg/kg白消安以上3個(gè)劑量組(35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg)造模成功，獲得無(wú)精子癥模型動(dòng)物，且造模后 NIH 與ICR、BALB/c小鼠的外觀體征表現(xiàn)明顯不同，ICR 和BALB/c小鼠外觀體征表現(xiàn)輕微[5]。因此，本研究選用BALB/c雄性小鼠單次腹腔注射30 mg/kg、40 mg/kg的白消安來(lái)建立生精功能障礙動(dòng)物模型。

王德志[14]研究中，小于20 mg/kg的白消安不會(huì)造成BALB/c小鼠死亡， 30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg的死亡率可達(dá)到為6.5%、86.7%、100%。本研究過(guò)程中僅有40 mg/kg組中出現(xiàn)1只死亡，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P﹥0.05無(wú)差異學(xué)統(tǒng)計(jì)意義，這一結(jié)果與研究報(bào)道不符，其可能原因是種屬間個(gè)體差異，導(dǎo)致了死亡率的差異，有待于大批量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重復(fù)劑量組進(jìn)行驗(yàn)證。

白消安在損傷生精細(xì)胞的同時(shí)，有較強(qiáng)的骨髓抑制作用[15]，可導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良。本研究中白消安組第2、4、6、8、10周體重均低于對(duì)照組，且第2～4周40 mg/kg組體重下降趨勢(shì)大于30 mg/kg組；第6～10周實(shí)驗(yàn)組小鼠體重出現(xiàn)恢復(fù)，但40 mg/kg組恢復(fù)慢于30 mg/kg組，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。另外，在第2周取樣時(shí)，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)白消安組睪丸體積小于同期生理鹽水組睪丸體積；第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸體積減小二分之一；10周時(shí)實(shí)驗(yàn)組睪丸體積仍小于對(duì)照組，但30 mg/kg組恢復(fù)狀態(tài)較40 mg/kg組好。這一結(jié)果表明白消安可以使睪丸發(fā)生萎縮，可能與其生殖毒性、骨髓抑制相關(guān)。

白消安作為一種烷化劑，是一種強(qiáng)化療藥，主要通過(guò)損傷DNA鏈來(lái)抑制細(xì)胞分裂，但不影響DNA的合成[16-17]。因此，具有高度分裂的器官、組織、細(xì)胞更易受到白消安毒性的影響，例如睪丸、生精細(xì)胞[18]。在精子發(fā)生過(guò)程中，二倍體生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂過(guò)程分化為圓形單倍體精子細(xì)胞。所以，白消安的細(xì)胞毒性可以使小鼠的生精細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程阻滯，當(dāng)白消安對(duì)處于G1期的細(xì)胞產(chǎn)生毒性后，將抑制下一階段的有絲分裂[19-20]。本研究中注射白消安2周模型鼠睪丸組織HE染色后觀察到生精細(xì)胞有斷裂現(xiàn)象，4周時(shí)30 mg/kg組、40 mg/kg組生精小管基本都處于空泡化程度，說(shuō)明生精細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程被抑制，與報(bào)道一致。由于臨床常見(jiàn)的非梗阻性無(wú)精子癥患者中，部分睪丸組織仍有生精功能，因此本研究通過(guò)Johnson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各階段模型小鼠進(jìn)行生精功能判定，選擇評(píng)分為3～5分時(shí)間段的動(dòng)物為疾病模型，作為睪丸組織體外培養(yǎng)研究對(duì)象。

STRA8在動(dòng)物生殖細(xì)胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)常預(yù)示著生殖細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)，SCP3是聯(lián)會(huì)復(fù)合體的重要組件，在減數(shù)分裂的過(guò)程中起著重要作用，可作為初級(jí)精母細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，TNP1是精子細(xì)胞特異性基因，主要在精子細(xì)胞變形階段表達(dá)，標(biāo)志生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂后期。經(jīng)白消安處理后，40 mg/kg組4～8周可分別模擬臨床上不同損傷程度的NOA患者，在睪丸組織中相關(guān)標(biāo)志物STRA8、SCP3、TNP1水平結(jié)合組織學(xué)變化，可以清晰的分辨生精功能阻滯在某一階段，更有利于評(píng)價(jià)體外培養(yǎng)用睪丸組織的培養(yǎng)效果。研究人員不斷探索尋找體外誘導(dǎo)精子發(fā)生的途徑，主要方式為細(xì)胞培養(yǎng)法及器官培養(yǎng)法，但精子發(fā)生是一個(gè)涉及細(xì)胞增殖和分化的復(fù)雜過(guò)程，需要睪丸組織的特定微環(huán)境，尤其是支持細(xì)胞[21]，因此推斷器官培養(yǎng)法比細(xì)胞培養(yǎng)法更有利于誘導(dǎo)精子體外發(fā)生[22]。Sato T. 等利用瓊脂糖凝膠培養(yǎng)法分別將胎鼠睪丸組織、新生鼠睪丸組織和成熟鼠睪丸組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂后標(biāo)志物精子頭粒蛋白ACROSIN和成熟精子標(biāo)志物GSG2均顯著上調(diào)表達(dá)，證實(shí)小鼠睪丸組織中的精原細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化成精子[23-25]。因此，建立穩(wěn)定且明確阻滯階段的NOA疾病動(dòng)物模型，對(duì)體外誘導(dǎo)精子發(fā)生十分有意義。

綜上所述，利用白消安建立BALB/c生精功能障礙動(dòng)物模型可操作性強(qiáng)、效果穩(wěn)定、阻滯階段明確、模型動(dòng)物存活率高，且以單次腹腔注射40mg/kg組周期短、損傷久、效果佳。

(圖2見(jiàn)封底)