卵裂期胚胎可溶性人類白細胞抗原G與妊娠結局的關系

耿蒙慧 邢阿英 王大琳 胡艷秋

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)的出現和發展為不孕不育癥患者帶來了孕育新生命的希望。然而，在過去近40年里，盡管試管嬰兒技術取得了長足地發展，其成功率卻達到了一個瓶頸，徘徊在40%～50%左右。如何判斷胚胎的植入能力一直是胚胎學家們努力攻克的難題，近年來，評估、挑選胚胎的方法不斷發展，用無創性方法評估胚胎備受關注。胚胎的無創評估是指不影響胚胎的正常發育環境，不會對胚胎產生負面影響，不直接損傷胚胎的評估方法[1]。蛋白質組學作為其中一種，能降低形態學評估來自不同人的主觀差異而前景可期。其研究發育中的胚胎產生和分泌的蛋白質，以反映胚胎發育狀態，揭示蛋白質功能與細胞生命活動的規律。目前可通過質譜法，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及其他電離方法等，精確、快速、簡便地測定微量樣品產生和分泌的蛋白質含量。近年來，對于人類白細胞抗原G (human leukocyte antigen G，HLA-G)的研究較多，HLA-G作為一種免疫抑制因子而調節母胎界面和母體的免疫反應，從而防止母胎免疫排斥的發生[2]。研究表明，HLA-G是評估胚胎質量的重要標志物[3]。胚胎培養液中可溶性HLA-G(soluble human leukocyte antigen G，sHLA-G)的存在有利于較高的胚胎植入率和妊娠率[4]。本文回顧性分析了胚胎培養液中sHLA-G與胚胎植入和妊娠的相關性，為胚胎質量的評判提供依據。

對象與方法

一、研究對象

選擇2017年5月—2018年5月在江蘇省蘇北人民醫院生殖醫學中心接受體外受精或卵胞漿內單精子注射胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI)的86例不孕患者，共計100個周期為研究對象。納入標準：女性年齡20～44歲、不孕年限≥1年、獲卵數≥1個。排除標準：子宮異常(肌瘤、子宮腺肌癥、子宮縱膈、其它先天或后天子宮畸形)、子宮內膜異位癥III或Ⅳ期、患者或其丈夫染色體異常及有內科合并癥如甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥和糖尿病等內分泌疾病、供卵/凍卵周期、補救ICSI、移植兩個胚胎后獲得單胚胎植入的。獲取胚胎受精后第3日行胚胎冷凍的單個胚胎培養液共計146份。按妊娠結局分為妊娠組和未妊娠組；另按移植胚胎中sHLA-G陽性情況分為2組：sHLA-G陽性組和sHLA-G陰性組，比較組間差異。本研究遵循的程序符合江蘇省蘇北人民醫院倫理委員會制定的倫理學標準，得到該委員會批準。

二、方法

1.胚胎及培養液的選擇：卵子取出后培養3～6 h加入處理后的精液，授精后20～21 h觀察受精情況，并將每個受精卵分別移入30 ulG1(Vitrolife，瑞典)培養液滴中蓋油，在37 ℃、6%CO2條件下孵育至移植前。胚胎分級標準：根據第三天胚胎形態和碎片多少，將胚胎分為4級：Ⅰ級：卵裂球大小均勻，胞質無異常，碎片<5%；Ⅱ級：卵裂球大小均勻或不均勻，碎片<20%；Ⅲ級：碎片 20%～50%；Ⅳ級：碎片>50%；可移植胚胎包括Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎。

2.胚胎培養液的收集和保存：將每個胚胎對應的培養液25 ul吸入0.5 mL Eppendrof管中，存放入-80 ℃冰箱以備檢測。

3.sHLA-G的檢測：采用雙抗體夾心法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試劑盒，定量檢測單個胚胎培養液sHLA-G濃度。sHLA-G試劑盒由捷克BioVendor Laboratory Medicine公司提供，試劑盒最低檢測限為1 ng/ml。一抗為鼠抗sHLA-G單克隆抗體，二抗為酶標的鼠源抗人微球蛋白單克隆抗體。按說明書操作。實驗所需設備有：Bio Tek Instruments(HIGHLAND PARK,BOX 998.WINOOSKI,VT 05404-0998,USA)光譜儀、微量振蕩器、水浴箱等。

4.胚胎的凍融移植：胚胎解凍后觀察，至少有6個細胞且細胞內碎片少于20%的胚胎被認為是可移植的，培養2 h后移植至宮腔內，最多移植2個胚胎。移植后常規給予黃體酮40～80 mg肌內注射，或陰道放置黃體酮陰道緩釋凝膠90 mg/d予以黃體支持。

5.確認妊娠：胚胎移植后14天，若患者血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)陽性，定義為生化妊娠；移植4～5周后，超聲檢查見孕囊或臨床證實為異位妊娠及宮內外同時妊娠，則定義為臨床妊娠。

結 果

一、研究對象的一般資料

妊娠組與未妊娠組患者的年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、授精方式、Gn天數、Gn總量、基礎性激素水平、HCG日子宮內膜厚度比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；妊娠組的竇卵泡數、獲卵數及成熟卵數均較未妊娠組高(均P<0.05)，見表1。

表1 妊娠組與未妊娠組基本信息比較Table 1 Comparison of general characteristics of the pregnant group and non-pregnant

二、檢測標準判讀

根據sHLA-G標準品稀釋倍數做標準曲線，求得sHLA-G濃度與吸光度(optical density，OD，450 nm)之間的線性回歸方程，由OD值推算各培養液中sHLA-G的含量，依據其妊娠結局做ROC曲線，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.746(95% CI：0.661-0.831)(見圖1)。計算截斷值a=1.253(靈敏度為69.2%，特異性為84.0%)，≥a則為 sHLA-G陽性，

圖1 培養液中sHLA-G預測胚胎植入的ROC曲線Figure 1 ROC curve for estimating the predictive value of sHLA-G in embryo culture medium of embryo implantation

三、第三日單胚胎培養液sHLA-G表達情況

行FET的86例患者, 共100個周期，146個胚胎成功移植。其中獲得臨床妊娠的有38個周期，65個胚胎成功植入，81個胚胎未植入。臨床妊娠率為38.0%(38/100)，妊娠組與未妊娠組之間sHLA-G含量平均值的差異(1.8 U/mLvs 0.8 U/mL)有統計學意義(P<0.05)，見表2；sHLA-G陽性組植入率(77.6%，45/58)高于sHLA-G陰性組(22.7%，20/88)，組間差異有統計學意義(P<0.05); sHLA-G陽性組平均sHLA-G濃度(2.4 U/mL)明顯高于sHLA-G陰性組(0.3 U/mL)，差異有統計學意義(P<0.05), 見表3；二元Logistic回歸分析結果顯示，胚胎培養液中sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。以植入與未植入胚胎的sHLA-G含量做散點圖，組間sHLA-G含量差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

表2 妊娠組與未妊娠組sHLA-G含量和植入率對比Table 2 Comparison of the mean value of sHLA-G and implantation rate between Pregnant Group and Non-pregnant Group

表3 sHLA-G陽性組與sHLA-G陰性組含量及植入率對比Table 3 Comparison of thesHLA-G levels and implantation rate between sHLA-G positive group and sHLA-G negative group

表4 二元Logistic回歸分析變量對胚胎植入的影響Table 4 Binary logistic regression analysis of factors on the implantation of embryos

圖2 植入組與未植入組sHLA-G含量分布圖Figure 2 The scattergram of sHLA-G levels in implantation group and non-implantation group

討 論

自1978年第一例試管嬰兒誕生以來，通過技術的革新，問題的突破及不斷的研究探索，輔助生殖技術在胚胎學家們的努力下持續發展，為人類造福。但仍存在一些亟需解決的問題，最主要是“一低一高”問題，即活產率低和多胎妊娠率高，為解決這個問題，更準確的評估胚胎發育潛能，挑選單個最優胚胎進行移植很重要。為了尋求無創，簡便，準確的評估方法，本研究通過分析植入與未植入胚胎的胚胎培養液中的sHLA-G含量，探討其是否可作為妊娠預測指標。首先從理論上來說：1996年Jurisicova等第一次研究證明了sHLA-G陽性胚胎的卵裂率更高，且sHLA-G的表達與胚胎植入存在正相關[4]，從此以后，許多研究者發表了關于胚胎培養液中sHLA-G的表達與胚胎妊娠結局關系的研究。Sher等的一項前瞻性隊列研究表明，胚胎在ICSI后46小時能產生sHLA-G預示著較好的妊娠結局[5]。德國的一項多中心研究表明，隨著胚胎發育階段的推進，sHLA-G陽性胚胎的比例隨之升高，且sHLA-G陽性胚胎發育至囊胚的可能性更大，sHLA-G水平可能是繼胚胎的形態學評分系統之后的第二個重要評判參考[6]。2017年發表的一篇薈萃分析表明胚胎培養液中sHLA-G的存在有利于較高的胚胎植入率和妊娠率[7]。其次從標本的檢測方面來講：一方面，胚胎生長發育的直接環境是胚胎培養液，胚胎從中汲取養分并分泌代謝產物。在基因——蛋白——代謝終產物這樣一個生物信息傳遞鏈中，蛋白質及代謝物是細胞生命活動的體現者，能反映胚胎的活力。另一方面，在一般情況下，第三天胚胎行移植或培養囊胚或冷凍保存后，卵裂期胚胎培養液均被遺棄，對其的收集及檢測既節約資源又對胚胎無任何損傷。

研究表明，HLA-G是人類主要組織相容性復合體，特異性表達于絨毛膜外細胞滋養層的母-胎界面，它除了能抑制NK細胞的自然殺傷和T淋巴細胞及抗原提呈細胞的免疫應答作用，使絨毛細胞滋養層細胞逃避殺傷，也可通過MEK1/2信號傳導通路促進HCG的表達，促進血管重塑及早期胚胎的著床和發育[8-9]。sHLA-G主要存在于早期胚胎的胚胎培養液中，羊水、母體血清、血漿和卵泡液中也可檢測到，已有多數研究結果提示，胚胎培養液中sHLA-G的存在與較高的胚胎植入率和妊娠率有關[7]。有研究稱妊娠早期胚胎培養液中sHLA-G與不明原因復發性流產及子癇前期相關[10-11]，但它們之間的關系尚無定論，由此可見，探究sHLA-G與胚胎植入及妊娠并發癥之間的關系對于挑選優質胚胎，改善妊娠結局很有意義。

sHLA-G在胚胎培養液中的表達多為定量研究，以往的多數研究中，由于測定sHLA-G的方法不盡相同，使用的試劑盒及操作步驟有所區別，所以使用不同的判定方法來界定sHLA-G陽性截斷值[6,12,13]。部分研究將可檢測到sHLA-G定為陽性，還有研究中直接給出陽性的濃度范圍，但并未解釋范圍的來源，故這些方法降低了不同研究之間可比性。還有一部分研究用Stoller的非參數判別分析確定陽性截斷值，即待測胚胎培養液中sHLA-G的平均熒光強度(mean fluorescent intensity,MFI)高于陰性對照MFI的10%即為sHLA-G陽性。由于實驗環境及試劑的不同，操作方法的差異使得不同研究之間的sHLA-G陽性/陰性的標準不同，這大大降低了不同研究之間可比性，偏倚較大。本研究依據標準曲線和培養液的sHLA-G的實際測定值來確定陰陽，由ROC曲線來確定截斷值，相比其他研究方法，其敏感性及特異性均較高，更加客觀地判定了sHLA-G陽性的界限。截斷值是錯誤最少的最好閾值，其假陽性和假陰性的總數最少。研究中ROC曲線下面積AUC為0.746，表明用胚胎培養液中sHLA-G含量評估胚胎的植入結局有中等度準確性。由于本研究樣本量不高，且為回顧性研究，偏倚不可避免，故而需加大樣本量進一步實驗。

本研究中妊娠組sHLA-G含量均值高于非妊娠組；sHLA-G陽性組的sHLA-G含量均值高于sHLA-G陰性組，表明用ELISA法檢測胚胎培養液中的sHLA-G是可行的。這與Noci等[12]的研究結果不同，他們認為移植胚胎中至少要有一個是sHLA-G陽性時才獲得妊娠，但多數實驗結果中妊娠組與非妊娠組胚胎均檢測到sHLA-G陽性的表達[7]。究其原因，一方面是研究方法之間的差異，另一方面，有研究表明不同發育時間的胚胎產生sHLA-G的量不同，培養24h(52%)、培養48 h(87%)、培養72 h(90%)的胚胎有sHLA-G的表達[14]。雖然多數研究均檢測的是第三天的胚胎培養液，但胚胎發育速度的不同必將導致sHLA-G含量的差異。

二元Logistic回歸分析去除混雜因素后的結果表明，胚胎培養液中sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨立危險因素，證明了胚胎培養液中的sHLA-G與妊娠結局相關，它可能是預測胚胎質量的一個標志物，此結果與多數已發表的研究結果類似[7，15]。卵泡的發育將直接影響胚胎的質量及妊娠結局[16]，本研究中，單因素分析中妊娠組的竇卵泡數、獲卵數及成熟卵數均高于未妊娠組，差異有統計學意義，但二元Logistic回歸分析表明竇卵泡數、獲卵數及成熟卵數與妊娠結局的關系不大，進而證明sHLA-G含量為影響胚胎植入的獨立危險因素。研究中收集并測定的是第三天的胚胎培養液中的sHLA-G含量，這些胚胎在第三天被冷凍，等待解凍后移植。這為評估胚胎質量提供了一種新思路，為復蘇周期胚胎移植的質量評估提供了新方法，爭取了時間。形態學評估法仍是臨床應用最廣的胚胎質量評估方法，因此，結合第三天胚胎的形態學評級及培養液中的sHLA-G含量挑選優質胚胎解凍移植，以提高胚胎植入率，是我們接下來的研究方向。

綜上所述，本研究結果表明可將胚胎培養液中的sHLA-G 水平檢測作為胚胎移植前無創性檢測項目，促進臨床中選擇性單胚胎移植的進行。在形態學評估的基礎上，將sHLA-G作為輔助生育中無創檢測項目，幫助選擇優質胚胎進行單胚胎移植，可以在提高胚胎著床率的同時降低多胎率。但本研究的局限是納入研究的樣本較少，需要更大規模的前瞻性研究來證明sHLA-G對于評估胚胎質量的可靠性。