空氣放電處理誘導尖孢鐮刀菌孢子的凋亡過程

劉夢蝶，姜慧雯，李 潔,2,3,*，嚴守雷,2,3，王清章,2,3

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學 環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070； 3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術研究中心，湖北 武漢 430070）

蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我國重要的水生經濟作物，深受國內外眾多消費者青睞。蓮藕在長期貯藏以及運輸中容易發生腐爛，腐爛是僅次于褐變的影響蓮藕品質的重要因素之一。實驗室前期研究發現，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是蓮藕采后的主要腐敗菌[1]。

空氣放電技術是將風機送入的空氣在高壓靜電處理下，通過一系列復雜的電離和結合過程，產生放電生成氣的過程，主要生成臭氧（ozone，O3）和負離子（包括O2-、O3-、H2O-等）。用一定濃度的放電生成氣對果品的貯藏環境進行處理，能夠抑制果實呼吸強度和微生物生長，有助于果蔬的保藏[2]。

凋亡是由高度進化后基因調控的一種細胞程序性死亡過程，普遍存在于動物、植物以及微生物中，對維持細胞穩態，衰老和分化等過程具有重要作用[3-6]。絲狀真菌在生長的各個階段經常會有凋亡現象出現，如異核體不親和和菌絲自溶，另外多種脅迫因子如紫外線、滲透壓、抗真菌藥物等均能誘導細胞凋亡[6]。很多學者以酵母凋亡通路為例，研究外界刺激下絲狀真菌凋亡特征事件發生的次序及關聯，結果發現，番茄紅素可以誘導尖孢鐮刀菌菌絲凋亡，凋亡細胞具有DNA斷裂、線粒體膜去極化和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）累積等特征[7]。實驗室前期研究表明空氣放電處理能顯著抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發，對尖孢鐮刀菌細胞活力及其超微結構、生理代謝和細胞膜等方面產生影響，達到抑菌作用[2,8-9]。本研究將從空氣放電處理誘導尖孢鐮刀菌孢子凋亡過程中的各種現象及可能存在的凋亡機制方面出發，進一步完善空氣放電處理抑菌機理，為空氣放電技術對果品腐敗的抑制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

尖孢鐮刀菌為蓮藕貯藏期病原菌，經本實驗室分離、純化、鑒定后保存備用。

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養基 北京陸橋技術有限責任公司；馬鈴薯葡萄糖水培養基 國藥集團化學試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、DCFH-DA ROS檢測試劑盒、Fluo-3 AM熒光探針 上海碧云天生物技術有限 公司；Rho123線粒體膜電位檢測試劑盒 上海貝博生物科技有限公司；Rhod-2 AM Ca2+熒光線粒體探針 美國AAT Bioquest公司；CaspACE FITC-VAD-FMK染液 美國 Promega公司。

1.2 儀器與設備

MIC-O3臭氧變送器 深圳市藍月測控技術有限 公司；QT2SVP500一體化臭氧發生器 深圳市松野電器有限公司；TFB-YA278負離子發生器 天長市創普電子有限公司；Guava easyCyte 8流式細胞儀 美國Merck Millipore公司；FACSVerse流式細胞儀 美國Becton Dicknson公司；F-4600熒光分光光度計 日本HITACHI公司；ECLIPSE Ti-S倒置熒光顯微鏡 日本Nikon 公司。

1.3 方法

1.3.1 尖孢鐮刀菌的空氣放電處理

F. oxysporum接種于PDA平板上，于26 ℃培養箱中培養6 d。密閉空氣放電設備內臭氧和負離子生成氣達到設定濃度后將平板分別放入臭氧（6.87 mg/m3）、負離子（5×106ions/cm3）、臭氧+負離子同時處理 （6.87 mg/m3+5×106ions/cm3）環境中，分別處理1、2、3、4、5 h，以不做任何處理為對照，向每個平板中加入1.5 mL無菌水，將其產生的分生孢子用無菌水潤洗至試管，然后離心（4 ℃、1000 ×g、5 min）收集孢子。

1.3.2 尖孢鐮刀菌孢子的凋亡雙染

用0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸1.3.1節得到的孢子并計數，取10 μL孢子懸液用190 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸洗滌，使孢子密度約1×106個/mL，加入用PBS稀釋10 倍后的Annexin V-FITC染色液5 μL，1 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液輕輕混勻，避光孵育20 min，采用FACSVerse流式細胞儀進行檢測。

1.3.3 尖孢鐮刀菌孢子ROS含量測定

按照1∶1000體積比用PBS稀釋熒光探針DCFH-DA至濃度為10 μmol/mL。取洗滌后的孢子，重懸于稀釋好的500 μL DCFH-DA中，孢子密度約1×106個/mL，室溫避光孵育1 h。PBS洗滌后，用Guava easyCyte 8流式細胞儀進行檢測，熒光強度與細胞內ROS水平成正比，故以熒光強度表征孢子ROS含量。

1.3.4 尖孢鐮刀菌孢子膜電位的測定

按照Rho123線粒體膜電位檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液及Rho123染色工作液（質量濃度50 μg/mL）。用500 μL Rho123染色工作液將孢子重懸，孢子密度約1×106個/mL，室溫避光孵育30 min，洗滌離心（4 ℃、3000×g、5 min）收集孢子，用500 μL染色緩沖液將孢子重懸，用Guava easyCyte 8流式細胞儀進行檢測，以熒光強度表征膜電位，熒光強度越大，膜電位越高。

1.3.5 尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的測定

Fluo-3 AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。Fluo-3 AM 的熒光非常弱，其熒光不會隨Ca2+濃度升高而增強。Fluo-3 AM 進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成Fluo-3， 從而被滯留在細胞內。Fluo-3可以和Ca2+結合，且結合后可以產生較強的熒光。

按照1∶10000體積比用PBS稀釋熒光探針Fluo-3 AM， 使終濃度為0.5 μmol/L。取30 μL收集的孢子懸液，重懸于稀釋好的200 μL Fluo-3 AM溶液中，孢子密度約2.5×106個/mL，室溫避光孵育50 min進行熒光探針裝載，PBS洗滌兩次（4 ℃、3000×g、5 min），再孵育20 min后用Guava easyCyte 8流式細胞儀檢測[10]，以熒光強度表征Ca2+濃度，熒光強度越大，胞漿Ca2+濃度越高。

1.3.6 尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的測定

Rhod-2 AM Ca2+熒光線粒體探針是一種Rhod-2的乙酰甲酯衍生物，進入細胞后被內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2，負載到細胞內。Rhod-2是一種可見光激發的高親和力Ca2+指示劑，能有效地將鈣熒光信號增加幾十倍。Rhod-2具有很強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+濃度變化，從而降低了對活細胞的光毒性；由于產生的熒光強度具有很強的Ca2+依賴性，對Ca2+濃度檢測的敏感度也更高，故以熒光強度表征Ca2+濃度。

利用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解Rhod-2 AM配制成質量濃度2 mg/mL的儲存液，分裝后于-20 ℃避光干燥密封保存，在使用前回溫至室溫，用PBS稀釋到質量濃度5 μg/mL。用稀釋好的300 μL Rhod-2 AM染色液重懸收集的孢子，使孢子濃度約為1×107個/mL。 室溫避光孵育40 min，PBS洗滌細胞兩次（4 ℃、3000×g、5 min），加入PBS緩沖液1.5 mL再室溫避光孵育30 min后用熒光分光光度計檢測。激發波長550 nm、發射波長580 nm[11]。

1.3.7 尖孢鐮刀菌孢子半胱天冬氨酸酶（metacaspase）激活的檢測

收集臭氧（6.87 mg/m3）、負離子（5×106ions/cm3）、 臭氧+負離子同時處理（6.87 mg/m3+5×106ions/cm3） 條件下處理5 h的分生孢子，懸浮在用PBS稀釋的CaspACE FITC-VAD-FMK （10 μmol/L）染液中，室溫避光孵育2 h，PBS洗滌一次（4 ℃、3000×g、5 min）后重懸，取適量在熒光顯微鏡下觀察染色情況[12]。

1.4 數據處理與分析

所得數據用Data Processing System 7.05軟件中的t檢驗進行顯著性分析，采用Origin 8.0軟件進行數據處理和圖表制作，流式細胞儀圖像由Flowjo 7.6軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 空氣放電處理誘導尖孢鐮刀菌孢子凋亡

圖 1 空氣放電處理尖孢鐮刀菌孢子FITC/PI雙染凋亡分析Fig. 1 Annexin V-FITC/PI double-staining analysis of apoptosis in F. oxysporum spores after air discharge treatment

如圖1所示，隨著處理時間的延長，負離子處理組早期孢子凋亡數（Q3）增多，處理5 h時，早期孢子凋亡比率從6.43%增加至28.3%，而晚期孢子凋亡數（Q2）和壞死數（Q1）基本無變化。臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組早/晚期孢子凋亡數和壞死數都明顯增加，且在每個處理時間點臭氧+負離子同時處理組孢子壞死數都明顯占優勢。

圖 2 空氣放電處理尖孢鐮刀菌孢子的凋亡率和壞死率Fig. 2 Apoptosis and necrosis rates of F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖2所示，負離子處理組和臭氧處理組孢子凋亡率隨著處理時間的延長呈現遞增趨勢，臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組孢子壞死率均在處理2 h時達到最大。臭氧+負離子同時處理1 h時，尖孢鐮刀菌孢子已表現出明顯壞死，壞死率明顯高于臭氧單獨處理。說明空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子存在誘導凋亡和壞死雙重作用。

2.2 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子ROS含量的影響

如圖3所示，空氣放電處理后，尖孢鐮刀菌孢子ROS含量增加，在處理過程中，臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組ROS含量均顯著高于負離子處理組 （P＜0.05）。臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組在處理2 h內ROS明顯上升，隨后上升趨勢減緩。而負離子單獨處理組在前3 h內ROS含量無明顯變化，處理4 h后ROS含量明顯升高。

圖 3 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子ROS積累的影響Fig. 3 ROS accumulation in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

2.3 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子線粒體膜電位的影響

圖 4 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子線粒體膜電位的影響Fig. 4 Detection of Δψm in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖4所示，隨著空氣放電處理時間的延長，孢子內線粒體膜電位逐漸下降。臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組在處理2 h內下降趨勢明顯，負離子處理組在處理1 h內下降趨勢明顯，在處理2 h后臭氧處理組和 臭氧+負離子同時處理組線粒體膜電位明顯低于負離子處理組（P＜0.05）。

2.4 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的影響

圖 5 空氣放電處理尖孢鐮刀菌Fluo-3 AM染色細胞分布直方圖Fig. 5 Fluo-3 AM stained cell distribution of F. oxysporum spores after exposure to air discharge

從染色細胞分布直方圖（圖5）中可以看出，隨著處理時間的延長，相較于臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組，負離子處理組染色細胞數變化不明顯。臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組染色細胞比率均在處理1 h達到最大值，分別為34.5%和44.8%。

圖 6 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2＋濃度的影響Fig. 6 Cytosolic Ca2+ levels in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖6所示，隨著處理時間的延長，相較于負離子處理組尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度緩慢上升，臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組Ca2+濃度在處理1 h時達到峰值，在處理2 h后有所下降，維持相對穩定的水平。不同處理組在各處理時間都有顯著性差異（P＜0.05），其中臭氧+負離子同時處理胞漿Ca2+濃度最高，其次是臭氧處理，負離子處理最低。

2.5 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的影響

圖 7 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2＋濃度的影響Fig. 7 Mitochondrial Ca2+ levels in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖7所示，隨著處理時間的延長，負離子處理組尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度緩慢上升，而臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組Ca2+濃度在處理1 h時已大幅度升高，之后減幅穩定上升。臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組與負離子處理組在各處理時間都有顯著性差異（P＜0.05），處理4 h后臭氧+負離子同時處理組與臭氧處理組有顯著性差異（P＜0.05）。

在處理1 h時，臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組胞漿（圖6）及線粒體Ca2+濃度（圖7）均顯著升高 （P＜0.05），而處理時間延長時，孢子內胞漿Ca2+濃度下降，線粒體Ca2+濃度繼續上升，可以推斷存在胞漿 Ca2+內流入線粒體。

2.6 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子內Metacaspase 活力的影響

Metacaspase是一類存在于真菌、植物及原生生物中的半胱氨酸依賴蛋白酶，與動物細胞中胱天蛋白酶（caspase）家族具有直接同源性，通過細胞內ROS的積累和線粒體功能的損傷對細胞凋亡起著關鍵作用[6,13-15]。 Z-VAD-FMK是一種廣泛的Caspase抑制劑，可以使用FITC-VAD-FMK（Z-VAD-FMK的FITC綴合物）檢測Metacaspase活力，該FITC綴合物被遞送到細胞中，與凋亡細胞中活化的Caspase特異性結合，產生熒光[16-18]。

如圖8所示，3 種處理組中部分細胞顯示出明顯的綠色熒光，而對照組未觀察到熒光，其中臭氧處理組和臭氧+負離子同時處理組染色細胞數及熒光強度明顯高于負離子處理組。表明空氣放電處理后，尖孢鐮刀菌孢子內Metacaspase活力明顯增強。

圖 8 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌孢子內Metacaspase活力的影響Fig. 8 Effect of air discharge on the activity of metacaspase in F. oxysporum spores

3 討 論

誘導細胞凋亡的兩個關鍵分子信號為ROS和Ca2+[19-20]。 細胞Ca2+超載或胞內Ca2+區域化分布的擾動會對細胞產生毒性并能引發細胞凋亡或細胞壞死[21]。有研究發現，胞漿內增多的Ca2+可促使ROS過量產生而引起膜脂質過氧化，破壞細胞膜及線粒體的結構與功能，激活內源性核酸酶等多種酶，引起核DNA降解而誘導凋亡 發生[22-23]。本實驗中空氣放電處理后胞漿和線粒體內 Ca2+濃度均迅速上升，因此，推測Ca2+超載是空氣放電誘導尖孢鐮刀菌孢子凋亡的原因之一。這與沈青山[24]的 研究發現麝香草酚是通過激活電壓門控鉀離子通道導致K+外流，最終導致黃曲霉孢子細胞凋亡不同。線粒體作為細胞能量代謝的中心，對細胞凋亡起到了關鍵作用[25]，是ROS產生的主要來源[26]。ROS在凋亡過程作為非常重要的信號和效應器，其積累可導致孢子內的蛋白質、脂質損傷，從而激活細胞內信號傳導級聯，誘導凋亡 發生[27-28]。侯穎等[29]研究了不同致死濃度ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）對釀酒酵母細胞凋亡的影響機制，結果表明ε-PL能夠誘導釀酒酵母細胞ROS迸發，使細胞進入凋亡早期階段。Savi等[30]在研究臭氧氣體破壞禾谷鐮刀菌（F. graminearum）和輪枝鐮孢菌 （F. verticillioides）菌絲形態造成細胞死亡的原因之一是細胞內ROS的異常產生積累，推斷存在細胞凋亡。ROS誘導的細胞損傷已被證明是念珠菌屬真菌常見的抗真菌機制，也有少量研究集中在一些絲狀真菌如曲霉菌[31]、絲核菌[32]和鐮刀菌[33]中。

在多種刺激誘導的細胞凋亡期間，線粒體膜電位的崩解是線粒體介導的細胞凋亡的重要事件，被認為是細胞內ROS水平升高的結果[34]；劉晶[35]以H2O2作為氧化損傷刺激物，研究從3 種乳酸桿菌中分離的S-層蛋白對HT-29細胞的線粒體凋亡通路的影響，發現氧化應激誘導的ROS過度觸發引起線粒體膜電位的下降，并且3 種菌株的S-層蛋白能顯著地降低HT-29細胞的線粒體膜電位。這種破壞造成線粒體膜孔的打開，導致凋亡因子和細胞色素c（cytochrome c，Cyt c）從線粒體釋放到胞質[36-37]。Cyt c是位于線粒體膜間隙的一種血紅素蛋白質，不僅在線粒體呼吸鏈中起重要作用，在復合酶III和復合酶IV之間傳遞電子，也作為一種多功能蛋白酶參與細胞的生長和凋亡[38]。細胞凋亡進程中下游Caspase的激活必須經由Cyt c與Caspase的結合[39]。Metacaspase是Caspase的同系物，被認定是存在于真菌、植物和原生生物凋亡過程中的引發物[18]。在真菌中，細胞凋亡途徑有Metacaspase獨立型和依賴型兩種[40]，本實驗表明空氣放電誘導尖孢鐮刀菌凋亡過程中會引起Metacaspase的激活，屬于Metacaspase依賴型；而毛霉素VI誘導尖孢鐮刀菌凋亡過程中，Metacaspase未激活[41]，屬于Metacaspase獨立型。

綜上研究結果表明，空氣放電誘導尖孢鐮刀菌孢子的凋亡過程是以線粒體為核心的凋亡機制，即空氣放電首先引起胞內Ca2+濃度的增加和ROS的積累，線粒體膜電位的去極化由線粒體ROS的產生引起，導致Cyt c從線粒體釋放到細胞質，激活Metacaspase，最終導致孢子凋亡。