p53 Arg72pro基因多態(tài)性與宮頸癌放化療敏感性的相關(guān)性

張紅麗 魯亮 曹輝 方春菊 朱海振 李勇

貴州省人民醫(yī)院腫瘤科（貴陽(yáng)550002）

宮頸癌是發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重影響著女性的生命健康［1］。中國(guó)的宮頸癌發(fā)病率是發(fā)達(dá)國(guó)家的6 倍，造成了嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)［2］。由于尚無(wú)特異性早期癥狀，超過(guò)60%的患者初診時(shí)即診斷為局部晚期宮頸癌，同期放化療為NCCN指南推薦標(biāo)準(zhǔn)治療模式，但其中29%～38%的失敗模式是未控或復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)患者的5年生存率僅為3.8%～13%［3］。研究顯示，放化療抵抗是腫瘤未控或復(fù)發(fā)的主要原因［4］。因此，如何在治療前預(yù)測(cè)患者對(duì)放化療的敏感性，對(duì)于指導(dǎo)后續(xù)治療顯得尤為重要。

p53 基因是目前發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤最相關(guān)的一種抑癌基因［5］，其在DNA 合成修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控以及基因組的完整性等方面發(fā)揮著重要作用。p53 基因結(jié)構(gòu)的改變已被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，大約50%的惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)有p53 基因的突變［6］。p53 基因72 密碼子的多態(tài)性（Arg72pro，rs1042522 C ＞G）與惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系是近年的研究熱點(diǎn)，目前已報(bào)道p53 Arg72pro 與胃癌［7］、乳腺癌［8］、肺癌［9］、卵巢癌［10］等發(fā)生均存在顯著關(guān)聯(lián)性。ROSHANI 等［11-12］研究發(fā)現(xiàn)p53 基因72 位密碼子Arg/Arg 基因型是宮頸癌的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素。P53基因的過(guò)度表達(dá)可降低射線敏感性，且不同基因型可表現(xiàn)出不同的射線敏感性。本研究擬通過(guò)檢測(cè)宮頸癌患者p53 Arg72pro 基因多態(tài)性與宮頸癌放化療敏感性的關(guān)系，揭示p53 不同基因型對(duì)宮頸癌放化療敏感性的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取貴州省人民醫(yī)院腫瘤科2013年1月至2016年3月收治的宮頸癌患者105 例為研究對(duì)象，年齡為25～74 歲，平均（51 ± 10）歲。中位隨訪時(shí)間為6 個(gè)月。該研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理組織學(xué)證實(shí)為宮頸癌；（2）FIGO 2009 分期為ⅡB?ⅣA 期；（3）年齡為18～80 歲；（4）ECOG 評(píng)分為0～2 分；（5）接受并完成根治性同期放化綜合治療；（6）有完整病例及隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）復(fù)發(fā)或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者；（2）放療未完成者；（3）接受與宮頸癌治療相關(guān)手術(shù)治療者，但不包括介入止血、介入灌注化療者。

1.2 治療及隨訪同期放化療期間兩組患者均采用直線加速器（瑞典醫(yī)科達(dá)公司設(shè)備型號(hào)：VER?SA HD）產(chǎn)生的6MV?X 線行圖像引導(dǎo)下的調(diào)強(qiáng)放療（IGRT），總劑量45 Gy/1.8 Gy/25 f，2 ～3 周后每周使用Ir192 高劑量率后裝治療機(jī)（荷蘭核通公司 設(shè)備型號(hào)：Microselectron）腔內(nèi)放療，6 Gy×5 f，與外照射相加等效劑量為85 Gy。體外放療和腔內(nèi)放療期間給予順鉑40 mg/m2/W（5 療程）。

經(jīng)治患者在同步放化療后定期隨訪，復(fù)查影像學(xué)（兩種以上影像學(xué)檢查或?qū)m頸刮片病理，有條件者可行全身PET?CT 檢查），測(cè)量腫瘤體積改變及明確有無(wú)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

1.3 放化治療敏感性評(píng)估根據(jù)患者同步放化療后4 周的療效評(píng)價(jià)結(jié)果，將宮頸癌同步放化療療效分為高敏感（CR + PR）和低敏感組（PD + SD）。療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)體瘤RECIST 標(biāo)準(zhǔn)（1.1 版）［13］評(píng)價(jià)療效。

1.4 基因多態(tài)性檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA 的完整性、采用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。采用PCR熒光探針?lè)▽?duì)研究對(duì)象進(jìn)行SNP 位點(diǎn)基因分型檢測(cè)，p53 Arg72pro（rs1042522）基因位點(diǎn)的檢測(cè)均設(shè)計(jì)3 條引物，包括2 條上游引物和1 條下游引物，其中2 條上游引物均在3′端的末位根據(jù)不同的SNP 堿基給予不同的錯(cuò)配，共用下游引物。根據(jù)NCBI 網(wǎng)站上公布的DNA全序列信息，在Primer Designer 6.0 版輔助下，自行設(shè)計(jì)引物，由Life 公司合成。P53 Arg72pro 上游引物為5′?CCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCG?3′，5′?CCAG?AATGCCAGAGGCTGCTCCCCC?3′，下游引物為5′?AGGAGCTGCTGGTGCAGGGGCCACG?3′。PCR反應(yīng)體系為10 μL，PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40 次，72 ℃延伸2 min，觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用確切概率分析法檢驗(yàn)Hardy?Weinberg 平衡；采用單因素和多因素logistic 回歸分析進(jìn)行放化療敏感性影響因素篩選。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算和制圖均通過(guò)Prism 8.0（GraphPad Software，San Diego）進(jìn)行。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因分布頻率及Hardy?Weinberg平衡檢驗(yàn)經(jīng)SNP 檢測(cè)，p53 Arg72pro C/C 基因型合計(jì)31 例，C/G基因型合計(jì)47例，G/G基因型合計(jì)27例。Hardy?Weinberg 平衡檢驗(yàn)顯示總體符合Hardy?Weinberg平衡，敏感或不敏感組患者均符合Hardy?Weinberg平衡（表1）。說(shuō)明該群體基因可靠，具備群體代表性。

表1 p53 Arg72pro 基因分布頻率及Hardy?Weinberg 平衡檢驗(yàn)Tab.1 Frequency of gene distribution of p53 Arg72pro and Hardy?Weinberg balance test 例

2.2 基因多態(tài)性與放化療敏感性單因素相關(guān)分析基于Codominant、Dominant、Recessive 和Over?dominant 的基因多態(tài)性與放化療敏感性單因素相關(guān)分析模型顯示，C/G 和G/G 的患者放化療敏感性比例高，是保護(hù)性基因。與C/C 基因型相比，不敏感的可能性降低一半以上（0.43），但四種模型結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.3 與宮頸癌放化療敏感性相關(guān)logistic 回歸分析單因素logistic 回歸分析結(jié)果顯示Ⅲ～Ⅳ期、低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會(huì)明顯降低放化療的敏感性（P＜0.05，表3）。經(jīng)年齡、分期、分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素校正后，多因素logistic 回歸結(jié)果顯示：p53 Arg72pro 基因型是宮頸癌同步放化療的獨(dú)立影響因素，其中C/G 基因型顯著增加了宮頸癌放化療敏感性。

表2 p53 Arg72pro 基因多態(tài)性與放化療敏感性單因素相關(guān)分析Tab.2 Univariate analysis for genetic polymorphism of p53 Arg72pro with chemoradiation sensitivity 例（%）

表3 影響宮頸癌放化療敏感性的logistic 分析結(jié)果Tab.3 Logistic analysis of clinical factors for chemoradiation sensitivity

3 討論

p53 基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了非常重要的作用，其突變可改變靶基因轉(zhuǎn)錄活性、抑制凋亡、抑制放化療敏感性以及抑制p53 家族成員（p63、p73）功能等，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［14］。研究發(fā)現(xiàn)p53 蛋白突變體可抑制DNA 雙鏈斷裂反應(yīng)信號(hào)通路，增加基因組不穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。由此可見(jiàn)，p53 基因可作為研究腫瘤放射敏感性的一個(gè)突破口［14-15］。WANG 等［16］收集52 例宮頸鱗癌患者放療前后活檢標(biāo)本，并檢測(cè)p53 蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)放療前高表達(dá)p53 蛋白的宮頸癌患者具有較差的預(yù)后，同時(shí)放療可誘發(fā)p53 基因突變，產(chǎn)生穩(wěn)定且有更長(zhǎng)半衰期的p53 蛋白突變體表達(dá)，致使宮頸癌患者預(yù)后進(jìn)一步惡化。而對(duì)于其具體的影響機(jī)制，有研究顯示，p53 可通過(guò)乙酰化/去乙酰化調(diào)節(jié)應(yīng)答射線引起的DNA 損傷等遺傳毒性，進(jìn)而影響放射敏感性等表型變化。

在本研究中，納入研究的宮頸癌患者Ⅲ～Ⅳ期比例較高（23.8%），這可能說(shuō)明貴州地區(qū)女性對(duì)該病知曉率不高，拖延診治時(shí)間，致使腫瘤進(jìn)展到較晚期。單因素相關(guān)性分析顯示，年齡、分期、分化程度、腫瘤大小以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均是放化療敏感性的相關(guān)影響因素：相比于年輕患者，年齡更長(zhǎng)的患者對(duì)放化療敏感度更低；相對(duì)于ⅡB 期患者，Ⅲ～Ⅳ期患者的放化療敏感性較低；腫瘤低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均降低了放化療敏感性。腫瘤分期及腫瘤大小在單因素相關(guān)中發(fā)現(xiàn)與放化療敏感性相關(guān)，但多因素分析中未發(fā)現(xiàn)與放化療敏感性存在顯著相關(guān)。這一現(xiàn)象說(shuō)明在腫瘤分期的相關(guān)性方面摻雜了其他混雜因素造成了假性關(guān)聯(lián)，這可能是由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等其他因素混雜引起的。放療和化療聯(lián)合是宮頸癌常見(jiàn)的治療方式，對(duì)二者的敏感性均由不同因素控制，兩者的混雜本身就給研究帶來(lái)了一些復(fù)雜性。前期一些研究表明增殖活躍的細(xì)胞比不增殖的細(xì)胞對(duì)放射敏感，細(xì)胞分化程度越高放射敏感性越低，反之愈高［17-18］。在臨床中筆者也發(fā)現(xiàn)，雖然有些患者宮頸癌已達(dá)Ⅲ～Ⅳ期，對(duì)于中、低分化及相對(duì)年輕的患者，放化療仍然有較好的效果。大部分鱗癌屬中度放射敏感，而大部分腺癌的放射敏感性與細(xì)胞的分化程度相關(guān)［19］。可見(jiàn)，傳統(tǒng)的臨床病理特征并不能準(zhǔn)確反映放化療的敏感性，對(duì)于上述某一臨床病理因素相同的患者，在采用標(biāo)準(zhǔn)的同步放化療治療方案后，其預(yù)后仍存在有很大差別。因此，進(jìn)一步豐富臨床指標(biāo)來(lái)評(píng)估和預(yù)測(cè)放化療敏感性是研究熱點(diǎn)，而p53 基因多態(tài)性就可成為潛在的評(píng)估放化療敏感性因素。本研究中納入的人群p53 Arg72pro基因位點(diǎn)檢測(cè)都符合Hardy?Weinberg 平衡，具備群體代表性。本研究結(jié)果顯示，C/G 和G/G 的患者對(duì)放化療更敏感，屬于保護(hù)性基因；而C/C 基因型則為危險(xiǎn)基因，會(huì)降低放化療敏感性。這與之前研究的C/C 基因型為易患癌基因有一定相似性，說(shuō)明p53 Arg72pro 位點(diǎn)C/C 基因型不僅增加患癌風(fēng)險(xiǎn)，也對(duì)放化療有一定抵抗。

本研究存在一定的局限性，首先，納入分析的樣本量較有限，會(huì)對(duì)分析結(jié)果造成一定的偏倚，但是本文在探究p53 基因型與放化療敏感性關(guān)系的同時(shí)，也納入考慮多個(gè)臨床因素并進(jìn)行校正，因此本文的分析結(jié)論具有一定的可靠性。同時(shí)，考慮到本研究使用療效評(píng)價(jià)指標(biāo)判定放化療敏感性，而缺少相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，如Fas、Fasl、Cox?2 等，以及p53 基因型對(duì)患者的順鉑化療的敏感性如何尚無(wú)法明確，因此需要后續(xù)細(xì)胞及分子生化水平探究明確。其次，本研究納入的患者局限在本院，并且大部分來(lái)自貴州地區(qū)，存在潛在的研究人群方面的選擇偏倚，即對(duì)于其他地區(qū)的宮頸癌患者是否適用本研究結(jié)論，尚需要進(jìn)一步探究。再次，lo?gistic 模型未經(jīng)外部隊(duì)列驗(yàn)證，因此，模型預(yù)測(cè)的穩(wěn)健性仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。