miR?511?3p調(diào)節(jié)小兒咳嗽變異性哮喘患者巨噬細(xì)胞極化和過(guò)敏性炎癥的機(jī)制

牟義飛 湯正珍 唐永恒 李啟飛

遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）兒科（貴州遵義563000）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是兒科中較為常見(jiàn)的一種區(qū)別于其他哮喘的特殊類哮喘疾病［1-2］。巨噬細(xì)胞存在功能多樣性和表型可變性等特性，成熟巨噬細(xì)胞可出現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象［3-5］，M1 極化主要是由IFNγ/GM?CSF/LPS 及其產(chǎn)物引發(fā)的巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子如IL?1、TNF?α等高表達(dá)，具有分泌炎癥因子的作用［6］。目前CVA發(fā)病的具體機(jī)制尚不清楚，多數(shù)研究者認(rèn)為CVA和典型哮喘機(jī)制相同，均是以慢性氣道高反應(yīng)和炎癥為主要本質(zhì)［7-8］。miR?511?3p 在轉(zhuǎn)錄上的共同調(diào)控與Mrc1 在調(diào)控巨噬細(xì)胞活化相關(guān)，并能增強(qiáng)腸道炎癥的功效［9-10］。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究選取2010年2月至2020年5月在本院就診后被確診為CVA且在兒科住院的患兒60例，咳嗽時(shí)間在1 ～7個(gè)月。入組標(biāo)準(zhǔn)：患兒無(wú)哮喘病史和家族史；咳嗽原因已排除胰腺囊性纖維化、鼻后滴流綜合組等系統(tǒng)性疾病；采血前半個(gè)月患兒無(wú)呼吸道感染；肺功能正常；X線胸片正常。患兒性別比例：男/女=45/55；年齡為（5.35 ± 2.10）個(gè)月；病程為（14.65±5.16）d。本研究已經(jīng)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試患兒的監(jiān)護(hù)人已簽署同意書(shū)。

1.2 材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人單核細(xì)胞系THP?1，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，采用RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57BL/6小鼠SPF級(jí)雄性，6 ～8周齡，購(gòu)自由河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（冀）2017?002。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：21～25 ℃，所有小鼠均可自由飲食，并給予12 h交替光照。

1.3 方法

1.3.1 巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)將培養(yǎng)成功的THP?1細(xì)胞用含PMA（200 ng/mL）的1640 培養(yǎng)基（碧云天公司）誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞，加入含LPS（500 ng/mL，碧云天公司）和IL?4（20 ng/mL，碧云天公司）的1640 培養(yǎng)基再次刺激24 h，形成了M1 和M2 型巨噬細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染收集M1 巨噬細(xì)胞，按照3 × 105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，放置24 h 后，按照TM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（碧云天公司）說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染miR?511?3p，設(shè)置陰性對(duì)照試驗(yàn)，4 h 后，用含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.3.3 RT?PCR 法檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)采集小鼠股靜脈外周血，加入抗凝劑后500 g 離心5 min，取沉淀，采用TRIol 法抽提細(xì)胞內(nèi)mRNA，按照RT?PCR 檢測(cè)試劑盒（碧云天公司）說(shuō)明書(shū)經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，獲得樣本CDNA，進(jìn)行M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的RT?PCR 基因檢測(cè)，用ΔΔct 法對(duì)其進(jìn)行定量分析，以GAPDH 作為內(nèi)參。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)采集小鼠股靜脈外周血，加入抗凝劑后500 g 離心5 min，取沉淀，取不同轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞，將其培養(yǎng)48 h 后，采用蛋白組織裂解液獲得蛋白樣本，Western blot法檢測(cè)M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)。

1.3.5 咳嗽變異性哮喘小鼠模型構(gòu)建除正常組外，分別采用氫氧化鋁和卵蛋白致敏并用的卵蛋白激活法構(gòu)建CVA 小鼠模型。建模后3 d 觀察小鼠毛色、精神、飲食、體溫均正常，分別在1 周和第2 周給予氫氧化鋁凝膠20 Ug 和卵白蛋白100 Ug腹腔注射，從第3 周開(kāi)始給予各組小鼠5%OVA 溶液12 mL 空氣壓縮霧化后吸入對(duì)其進(jìn)行抗原攻擊，連續(xù)13 d，每天1 次，30 min/次。從第29 天，給予其余組分別霧化后吸入給藥治療1 周。模型鑒定標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)監(jiān)視器觀察各組大鼠狀態(tài)，小鼠在經(jīng)過(guò)激發(fā)后出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、噴嚏、煩躁等現(xiàn)象時(shí)判定模型成功［11］。

1.3.6 ELSA 法檢測(cè)小鼠灌洗液中相關(guān)因子的表達(dá)收集各組小鼠灌洗液，按照ELISA 試劑盒（碧云天公司）在450 nm 處檢測(cè)各組吸光度值，計(jì)算灌洗液中巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志因子TNF?α、IL?1β、CCL22 和CCL17 表達(dá)。

1.3.7 ELISA 法檢測(cè)M1 和M2 細(xì)胞內(nèi)TNF?α和TGF?β的分泌量收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照ELISA 試劑盒（碧云天公司），在450 nm 處檢測(cè)各組吸光度值，計(jì)算M1 和M2 細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)TNF?α和TGF?β表達(dá)分泌量。

1.3.8 CVA 組患者體內(nèi)的miR?511?3p 表達(dá)通過(guò)5 000 g 離心5 min，獲得受試者血漿樣本，采用RT?PCR 法和Western blot 法，檢測(cè)血漿樣本中miR?511?3p 的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件；計(jì)量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較用χ2分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M1和M2巨噬細(xì)胞鑒定與對(duì)照組Mφ相比，M1巨噬細(xì)胞中TNF?α和IL?1β的表達(dá)較高；在M2 巨噬細(xì)胞中，CCL17 和CCL22 表達(dá)較高，M1 中TNF?α表達(dá)高于Mφ和M2，M2 中TGF?β表達(dá)高于Mφ和M1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同方式處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF?α、IL?1β、CCL22 和CCL17 的表達(dá)Tab.1 Expression of TNF?α，IL?1 β，CCL22 and CCL17 in macrophages after different treatments±s

表1 不同方式處理后巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF?α、IL?1β、CCL22 和CCL17 的表達(dá)Tab.1 Expression of TNF?α，IL?1 β，CCL22 and CCL17 in macrophages after different treatments±s

組別TNF?αTGF?βCCL22CCL17 Mφ組109.35±10.22110.24±12.29100.36±19.57111.21±23.62 M1組309.29±20.38389.56±18.5471.29±12.5769.98±18.52 M2組83.18±12.1793.86±11.90315.29±33.26332.75±39.86 F值36.39271.25652.36768.219 P值0.0010.0010.0010.001

2.2 miR?511?3p 轉(zhuǎn)染后M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因mRNA 的表達(dá)向M1 型細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR?511?3p，通過(guò)RT?PCR 法發(fā)現(xiàn)TNF?α 表達(dá)減少，CCL17 表達(dá)增多（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因的表達(dá)Tab.2 Expression of M1 macrophage related marker gene x±s

2.3 miR?511?3p 轉(zhuǎn)染后M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因蛋白的表達(dá)TNF?α蛋白表達(dá)減少，CCL17 蛋白表達(dá)增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因蛋白的表達(dá)（Western Blot）Fig.1 Expression of M1 macrophage related marker gene protein（Western blot）

2.4 ELSA 法檢測(cè)小鼠灌洗液中相關(guān)基因的表達(dá)M1 和M2 細(xì)胞分泌的TNF?α和TGF?β，CVA 組TNF?α減少，TGF?β增多（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因的表達(dá)Tab.3 The expression of M1 macrophage related marker gene x±s

2.5 CVA 組患者體內(nèi)miR?511?3p 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平CVA 組與對(duì)照組相比，血漿內(nèi)miR?511?3p的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 CVA 組患者體內(nèi)miR?511?3p 表達(dá)Tab.4 The expression of mir?511?3p in CVA group x±s

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)miR?511?3p 可通過(guò)降低CVA 患者IRF3 磷酸化水平，抑制巨噬細(xì)胞M1 相關(guān)標(biāo)志物的分泌［12-14］。巨噬細(xì)胞隨著微環(huán)境的變化可進(jìn)行重新分化，其極化具有可塑性，能對(duì)復(fù)雜環(huán)境變化做出較有效、快速的應(yīng)答［15］。采用LPS 體外刺激作用下的巨噬細(xì)胞在經(jīng)過(guò)IL?4 繼續(xù)刺激后，能夠得到M2 型巨噬細(xì)胞，相對(duì)的刺激順序調(diào)換后得到了M1 型巨噬細(xì)胞［16］。其中M1 型巨噬細(xì)胞主要包含M1 和M2 特點(diǎn)，M2 型巨噬細(xì)胞主要為M2 特點(diǎn)［17］。在M1 極化的信號(hào)通路研究中，發(fā)現(xiàn)IFN?γ能夠直接促進(jìn)機(jī)體內(nèi)NOS2、MHCⅡ和ILL?2 表達(dá)上調(diào)［18］。巨噬細(xì)胞極化不僅參與炎癥消退、發(fā)展和細(xì)胞凋亡過(guò)程，NF?κB 通路的激活劑IKKβ還能直接抑制機(jī)體內(nèi)STST1 活性，促使細(xì)胞向M2 極化。M2 激活途徑主要受到STAT6 介導(dǎo)。結(jié)直腸炎小鼠機(jī)體內(nèi)IRAK1、ERK、JNK 基因磷酸化通路被阻斷后可促使機(jī)體M1 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2 型極化，其炎癥效果減輕的同時(shí)，小鼠結(jié)直腸炎也得到了改善［19］。

在人巨噬細(xì)胞中含有多種miRNA 在M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞存在著明顯的表達(dá)差異，如miR?155、miR?132、miR?27a 等［20-21］。miR29b 和miR125a?5p 均靶向抑制TNFAIP3，TNFAIP3 屬于NF?κB 信號(hào)通路抑制劑，miR29b 和miR125a?5p 又可通過(guò)抑制TNFAIP3 表達(dá)促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)升高，證實(shí)miRNA 可通過(guò)改變巨噬細(xì)胞極化通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，參與機(jī)體巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用［22］。miR511 可通過(guò)不同的靶點(diǎn)作用促進(jìn)M1/M2 型巨噬細(xì)胞極化。miR?511?3p 在體內(nèi)具有抗炎效果，能用于治療哮喘，且在CVA 患者中MR 可與miR?511?3p 協(xié)同表達(dá)，抑制細(xì)胞M1 極化，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥。

綜上所述，miR?511?3p 可通過(guò)體外抑制IRF3磷酸化水平，抑制巨噬細(xì)胞M1 極化，促使其向M2方向極化，同時(shí)抑制機(jī)體內(nèi)過(guò)敏性炎癥反應(yīng)。