精子線粒體功能檢測與男性不育相關性的研究進展

李紅林，傅廣波，呂述彥（南京醫科大學附屬淮安第一醫院生殖醫學中心，江蘇淮安223300）

不孕不育癥指育齡夫婦未采取任何避孕措施，有規律性生活12個月內女方未獲得臨床妊娠［1］。據WHO估計全球約有1.9億人患有不孕不育癥［2］，其中約50%是由男方因素導致的不育癥［3］。臨床工作中，男性不育癥的篩查和診斷主要是依據精液量、精子濃度、精子活力和精子形態等指標的檢驗結果［4-5］，但大約30%～50%的特發性男性不育癥患者的精液常規檢驗指標卻完全正常［6］。線粒體是唯一含有獨立基因組的細胞器，通過氧化磷酸化產生的適量活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）維持精子活力、獲能、頂體反應和DNA完整性［7］。精子線粒體損傷會引發能量合成障礙，導致精子質量和功能下降、甚至消失?，F對近年來應用精子線粒體分子結構和功能檢驗指標評估男性生育力的研究進展作一綜述，為男性不育癥發病機制的研究以及精子線粒體功能檢測指標的臨床應用提供參考。

1 精子線粒體功能與ROS

精子細胞中線粒體數超過103個/細胞。精子發育成熟過程中，隨著其他細胞器和細胞質的消失，線粒體的數量和結構也發生顯著變化，當精卵結合形成受精卵時，精子線粒體會通過自噬途徑被完全降解清除［8］。在成熟精子中僅有約80個線粒體［9］，首尾相連并螺旋形地纏繞在鞭毛周圍，形成厚的線粒體鞘，位于精子尾中部的外質膜下方［10］，是精子內能量轉換和新陳代謝的關鍵部位，與精子的發生發育、凋亡和受精過程密切相關，其功能主要有［11］：（1）通過氧化磷酸化合成ATP，為精子運動提供主要的能量來源；（2）通過“固有”凋亡途徑調控精子凋亡，維持男性生育力；（3）產生ROS；（4）維持精子內鈣穩態；（5）參與類固醇激素的生物合成；（6）維持人類精子頂體酶活性、頂體反應和染色質完整性，直接影響精子的受精能力［7］。其中精子線粒體氧化磷酸化過程中產生的ROS是一把雙刃劍：適量的ROS是精子酪氨酸磷酸化-去磷酸化、膽固醇外排的必要條件，參與精子成熟、獲能和精卵結合過程；但精索精脈曲張［12］、環境污染［13］、藥物［14］、高溫、吸煙、肥胖等因素引起精子產生過多ROS而又無法及時清除時，會導致氧化應激，引起脂質過氧化、ATP生成減少，損傷精子DNA（包括線粒體DNA）和線粒體膜，導致線粒體膜電位（MMP）下降，破壞軸絲、鞭毛等結構，誘導生殖細胞凋亡，降低精子濃度、活力，增加精子畸形率，從而影響男性生育力。輔酶Q10、維生素E等抗氧化劑則可降低ROS、改善精子質量，提高男性生育力［15］。

2 精子線粒體膜電位（MMP）與男性不育

精子線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）是指在精子能量代謝過程中，電子經呼吸鏈傳遞產生ATP，同時復合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ將質子從線粒體內膜基質側泵至內膜外所形成的跨膜電位差。在正常的線粒體中，跨膜電位差反映了電子傳輸和氧化磷酸化的過程，該過程驅動線粒體ATP的產生。因此，MMP是反映精子線粒體功能的關鍵指標。

MMP可反映精子質量與線粒體功能之間的密切關系。早在1982年，Evenson等［16］就發現弱精子癥患者精子MMP水平較低。研究進一步證實MMP與精子活力、正常形態之間存在相關性［17］。楊穎等［18］報道弱精子組MMP低于對照組，且MMP與精子活動率、前向運動精子百分率及正常形態精子百分率呈正相關。Zhang等［7］報道正常水平的精子MMP是維持精子頂體酶活性和染色質完整性的生理基礎，MMP低的精子不易進行頂體反應。因此，國外學者建議對不明原因不育夫婦且男方精子MMP水平較低時，采用卵細胞質內單精子注射技術（ICSI）治療［19］。MMP和精子DNA碎片指數（DFI）聯合預測女性配偶自然受孕的能力優于精液常規參數［20］，是臨床評估特發性男性不育的重要指標［21］。

精子冷凍復蘇過程會導致線粒體超微結構紊亂，ROS生成增加，ATP生成減少、MMP下降。在冷凍保護劑中補充抗氧化劑左卡尼汀［22］、白藜蘆醇［23］等則可明顯改善冷凍損傷后精子的MMP水平，從而提高精子活力和存活率。這可能是因為抗氧化劑清除了線粒體膜上過量的長鏈脂肪?；S持線粒體膜通透性轉換，抑制線粒體電子傳遞鏈系統釋放電子，減少了ROS生成。

3 精子線粒體DNA（mtDNA）與男性不育

線粒體不同于其他細胞器的特征是其含有獨立的基因組，即線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），含37個基因，可編碼13種多肽參與氧化磷酸化過程。mtDNA是無保護性組蛋白的環狀雙鏈結構，可通過高速D環復制方法獨立于核DNA進行復制，且無修復系統。因此，與核基因組相比，它更容易被氧化應激破壞［24］。

3.1 mtDNA缺失 在氧化磷酸化缺陷患者的線粒體基因組中已鑒定出超過50個點突變和大量復雜的重排，如缺失和重復。mtDNA缺失（mtDNA deletion，mtDNAdel）主要發生在2個mtDNA復制叉之間的大弧中。4 977位點缺失是少精子癥和弱精子癥患者mtDNAdel發生率最高的位點，缺失頻率與8-羥基-2-脫氧鳥苷（氧化性DNA的生物標志物）含量之間存在正相關，說明ROS引起的DNA氧化損傷可能被固定為精子線粒體中mtDNA的大規模缺失［25］。弱精子癥患者精子mtDNA較常見的缺失位點還有7 345、7 436、7 599、4 866位點等［26-31］，且常發生大規模的mtDNA多個位點缺失。由缺失mtDNA編碼的呼吸鏈蛋白質多存在功能缺陷，會增強ROS或自由基產生，引發ATP生成障礙，進一步損傷mtDNA，如此惡性循環導致精子陷入能量危機和活力下降，造成男性生育力低下。

3.2 mtDNA拷貝數變異 拷貝數是指某基因在某一生物基因組中的個數。mtDNA拷貝數（mitochondrial DNA copy number，mtDNAcn）是指每個精子中的mtDNA數。正常成熟精子總共約有1 000～1 500個mtDNAcn。mtDNAcn變異被認為是導致男性不育的一個重要因素。Rosati等［30］從美國16個縣招募了384對夫妻，檢測了男方精液樣本的mtDNAcn和mtDNAdel，并用離散時間比例風險模型評估1年內女性伴侶懷孕概率，結果表明mtDNAcn可能是男性生育力更準確的預測指標。Wu等［32］報道在實施人類輔助生殖技術的人群中，精子mtDNAcn變異和mtDNAdel與受精率均呈負相關，與受精后第3天的優質胚胎率呈正相關。但Tiegs等［33］報道精子mtDNAcn在接受ICSI治療的不育人群中，不能預測卵子受精率、可利用胚胎率和活產率。研究結論差異可能與研究所選人群不同有關，需進一步擴大研究人群樣本量和種族。

3.3 mtDNA點突變 除mtDNA缺失位點、頻率和拷貝數異常與男性不育密切相關外，mtDNA點突變也可能影響線粒體蛋白功能，導致精子ATP生成減少，影響精子活力。Baklouti-Gargouri等［34］研究發現所有弱精子癥患者精子mtDNA均發生了細胞色素氧化酶Ⅲm.9588G＞A的突變。Holyoake等［35］研究發現mtDNA ATPase6基因上T8821A位的點突變可能因影響精子成熟而引起男性不育。但也有文獻報道［36］，大多數與男性不育相關的mtDNA多態性在普通人群中更為普遍，兩者之間沒有關聯性。Mao等［37］最新報道顯示，在使用體外受精/卵細胞質內單精子注射（IVF/ICSI）受精失敗的人群中，精子線粒體還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶亞基5（ND5）和NADH脫氫酶亞基6（ND6）基 因 中C12417T、C13650A、C13765A、T13769C、C13785A和C13845T等6個位點的基因變異率在受精失敗人群中高于正常受精組，提示這些mtDNA位點突變與精子的受精能力密切相關。未來需進一步探索引起男性不育的特異性mtDNA突變位點，為男性不育的基因診斷和科學防治提供依據。

4 精子線粒體功能檢驗

線粒體鞘由富含半胱氨酸和脯氨酸的硒蛋白組成，該結構蛋白中含多個二硫鍵，在成熟的精子中無酶活性，導致精子線粒體特別難以分離，因此大多數對精子線粒體功能的測定都利用原位分析或去膜精子。目前，評估精子線粒體與男性生育力關系的檢驗指標有精子線粒體的超微結構、mtDNA點突變、mtDNA重復或缺失、精子線粒體完整性、mtDNA拷貝數、ROS、MMP水平、線粒體活性和線粒體鈣離子水平［24］等。目前，使用較廣泛的指標是精子MMP水平和mtDNA的分子生物學檢驗。

4.1 MMP檢驗 MMP水平不僅反映精子線粒體的能量狀態，還與精子活力密切相關，因此，國外學者建議將精子MMP作為評估男性不育的常規指標［17］。通常選用5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花菁碘化物（JC-1）、四甲基羅丹明甲酯高氯酸鹽（TMRM）、羅丹明123（Rh123）等熒光探針染色線粒體，經熒光顯微鏡或流式細胞術檢測MMP。人類精子MMP檢測常用熒光染料的比較見表1。其中JC-1作為熒光染料檢測精子MMP水平［4］，是評估精子線粒體功能的特異性高、可靠性強的最為常用的方法。該方法的原理是精子MMP水平正常時，JC-1因極性作用進入線粒體內，并隨著濃度增高而形成發射紅色熒光的多聚體，當精子MMP水平降低時，線粒體內JC-1濃度降低，并逆轉為發射綠色熒光的單體形式，因此可通過檢測熒光變化來檢測MMP水平。但該方法檢測抗氧化劑治療過的精子標本時，MMP檢驗結果與精子活力、ATP濃度多不一致，因此，Uribe等［38］推薦當精液中存在抗氧化劑時，應用TMRM作熒光探針檢測精子MMP的變化。TMRM進入精子并積累在線粒體中，并隨著線粒體膜電位的增加發出紅色熒光。

表1 人類精子MMP檢測常用熒光染料比較

4.2 mtDNA分析 mtDNA突變包括缺失、點突變和重排突變。mtDNA的缺失型與野生型能共存于同一細胞，這種現象稱為mtDNA異質性。mtDNA異質性的存在增加了其檢測難度。目前多采用實時熒光定量PCR技術檢測其拷貝數或運用長鏈PCR結合引物遷移技術檢測其完整性，線粒體全基因組測序技術通量大、覆蓋度廣，可檢測mtDNA未知變異，但因成本高昂、多用于科學研究。精子mtDNA檢驗常用引物見表2。

表2 精子mtDNA檢驗常用PCR引物

5 總結

精子線粒體具有不同于其他體細胞線粒體的獨特特征，影響著精子的活力、獲能、頂體反應和最終受精能力等。MMP水平的變化、mtDNA突變或缺失均可引起精子能量合成障礙，導致男性不育。mtDNAcn是評估男性生殖健康及預測其女性配偶成功妊娠的生物標志物。MMP的檢測通常使用JC-1探針，必要時應選用TMRM，以避免抗氧化劑對檢測結果的干擾。