不育男性Y染色體微缺失與輔助生殖助孕結局的關系*

侯建華，馬玉珍，孫文芳，陳紅，任宇（內蒙古自治區人民醫院生殖醫學中心，呼和浩特010051）

據WHO統計，育齡期夫婦中不孕不育比率約為10%～15%，男性因素占30%～50%［1］，其中由染色體所致的遺傳因素約占男性因素的30%［2-3］，是男性不育癥的重要因素之一。Y染色體微缺失已經成為繼克氏綜合征后的又一大男性不育的遺傳學因素［4］，受到越來越多的關注、重視和深入研究。輔助生殖技術作為治療不育癥的重要手段之一，已日益成熟并廣泛應用。但該技術在成功幫助不育夫婦實現生育后代的同時，也在很大程度上將某些遺傳性不育的基因垂直傳遞給了后代，所以在決定采用輔助生殖助孕技術之前，對不育患者進行染色體等遺傳學檢測非常必要。1976年Tiepolo等［5］首次發現無精子癥與Y染色體長臂上的微缺失有關，推測與Y染色體長臂1區1帶（Yq11）的精子生成基因或無精子因子（azoospermia factor，AZF）基因家族相關［6-7］。Dohle等［8］對原發性無精子癥和少精子癥患者分析發現，存在Y染色體AZF的微缺失，提示AZF微缺失可能是造成男性原發性不育的重要遺傳因素之一，AZF基因片段的丟失可能造成生精障礙。研究證實［9-10］，Y染色體長臂（Yq）AZF a、b和c區域中的一個或多個部位出現缺失時，將會造成精子發生障礙，進而導致少精子癥甚至無精子癥的發生，從而影響男性生育能力。本研究探討不育男性Y染色體微缺失與輔助生殖助孕結局的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年5月至2020年12月在內蒙古自治區人民醫院生殖醫學中心就診的進行染色體檢查及Y染色體微缺失檢測的346例少精子或無精子的男性不育癥患者，分為3組：A組為無精子癥組（105例），年齡（33.5±3.9）歲；B組為重度少精子癥組（75例），年齡（34.1±4.1）歲；C組為輕、中度少精子癥組（166例），年齡（34.2±4.3）歲。3組間年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。排除女方子宮內膜及卵子因素（子宮內膜異位癥、卵巢囊腫、多囊卵巢綜合征等），僅納入男方精子因素及女方輸卵管因素的94例患者進行體外受精（IVF）/卵細胞質內單精子注射（ICSI）助孕治療。

1.2 主要儀器與試劑 外周血DNA柱式小量提取試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技公司，Y染色體微缺失檢測試劑盒購自上海透景生命科技公司。根據歐洲男科協會（European Academy of Andrology，EAA）、歐洲分子遺傳實驗質控網（European Mo-lecular Genetics Quality Network，EMQN）2013版推薦標準進行Y染色體微缺失檢測。該試劑盒采用2管多重PCR擴增、4個通道［（羧基熒光素（FAM）/綠 色 熒 光蛋白（VIC）/羧基-X-羅丹明（ROX）/花菁素（Cy5）］熒光檢測的方法，判斷AZF a、b、c區域6個序列標簽位點（sequence tag site，STS）的微缺失，同時設置2個內對照基因：男性性別決定基因（sex-determining region of the Y chromosome，SRY）和編碼鋅指蛋白基因ZFX（zinc finger protein，X-linked）/ZFY（zinc finger protein，Ylinked），對標本采集、抽提、PCR整個過程進行質控。

1.3 方法

1.3.1 精液常規檢查 根據《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）的標準［11］，用SSA-Ⅱ精子自動檢測分析系統（穗加軟件公司）檢測。按WHO規定，至少2次常規檢查無精子，離心沉淀后仍未見精子的診斷為無精子癥。精子濃度＜5×106/mL為重度少精子癥；5×106/mL≤精子濃度＜10×106/mL為中度少精子癥；10×106/mL≤精子濃度＜15×106/mL為輕度少精子癥。

1.3.2 Y染色體微缺失檢測 采用外周血DNA柱式小量提取試劑盒提取外周血DNA，采用Y染色體微缺失檢測試劑盒及熒光PCR儀進行Y染色體微缺失的檢測。

1.3.2.1 DNA提取 按照外周血DNA柱式小量提取試劑盒的使用說明書提取外周血DNA。取200μL外周血加入蛋白酶K及裂解緩沖液進行蛋白質裂解，再加入無水乙醇離心漂洗沉淀提取DNA，-20℃保存備用。

1.3.2.2 PCR擴增 采用25μL反應體系，包括22.5μL a組或b組PCR預混液，2.5μL核酸樣本或陰性對照或質控品。PCR反應條件：第1階段為50℃2 min，1個循環；第2階段為95℃5 min，1個循環；第3階段為95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，38個循環；第4階段為72℃5 min，1個循環。信號收集：在第3階段60℃時收集FAM/VIC/ROX/Cy5信號，并保存相關文件。

1.3.2.3 結果判讀 見表1。

表1 Y染色體微缺失檢測結果判讀說明

1.4 統計學分析 用SPSS17.0統計軟件進行。結果以率（%）表示，組間率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別Y染色體微缺失結果的比較 346例男性不育癥患者中共檢出AZF微缺失17例，總缺失率為4.91%（17/346）。在105例無精子癥組（A組）中有9例微缺失，其中5例為AZF c區缺失，2例為AZF b區缺失，1例為AZF b+c區缺失，1例為AZF a+b+c區全部缺失，其中2例2～3個AZF區域同時缺失的患者又進行再次抽血復查，結果與原結果一致；75例重度少精子癥組（B組）中有6例微缺失，均為AZF c區缺失；166例輕、中度少精子癥組（C組）中有2例微缺失，均為AZF c區缺失，結果見表2。結果顯示，A組的缺失率（8.57%，9/105）、B組的缺失率（8.00%，6/75）高于C組的缺失率（1.26%，2/166），χ2分別為5.466、7.171，P均＜0.05；但A組與B組相比較，差異無統計學意義（χ2為0.242，P＞0.05）。

表2 不同組別Y染色體微缺失種類分布及缺失率的比較

2.2 有無Y染色體微缺失患者IVF/ICSI助孕結局比較 17例Y染色體微缺失患者中有4例無精子癥患者為生精功能障礙型，通過睪丸/附睪穿刺均未找到精子，4例通過精漿果糖及生殖激素等輔助檢測判斷為非梗阻性無精子癥，以上8例均未行助孕治療，其余9例Y染色體微缺失患者均進行了IVF/ICSI助孕治療。本研究入組的94例進行助孕的夫婦，不孕原因女方排除排卵障礙、卵巢功能早衰、子宮內膜因素等，只有輸卵管因素，其余均為男方嚴重少精子或無精子癥因素。有Y染色體微缺失患者與無Y染色體微缺失患者IVF/ICSI妊娠結局比較見表3，兩組妊娠率及活產率差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

3 討論

本研究選取由EAA及EMQN推薦的AZF a（sY84、sY86）、b（sY127、sY134）及c（sY254、sY255）3個區域6個位點的基因缺失進行分析，研究其與嚴重少精子癥及無精子癥的關系，這也是目前對于男性不育癥診斷和治療的共識［12-13］。結果顯示，346例進行Y染色體微缺失檢測的患者中共計17例存在Y染色體微缺失，總缺失率為4.91%。按照精子質量的嚴重程度分成無精子癥（A）組、重度少精子癥（B）組及輕、中度少精子癥（C）組，其Y染色體微缺失率分別為8.57%、8.00%和1.26%，A組和B組的Y染色體微缺失率均高于C組（P均＜0.05），但A組與B組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。國內許多生殖中心也有關于無精子癥、少精子癥相關Y染色體微缺失發生的報道，但結果變異較大［14-16］。

隨著輔助生殖技術的蓬勃發展，IVF/ICSI技術用于治療男性不育已廣為接受。Y染色體微缺失是否會影響IVF/ICSI的治療結局，目前國內報道不多且結果不一、尚存爭議。本研究346例中的94例進行了IVF/ICSI助孕治療，結果顯示Y染色體微缺失組與無缺失組相比，臨床妊娠率及活產率差異無統計學意義（P＞0.05）。研究顯示［17-18］，Y染色體微缺失可能與流產有關，尤其是AZF c區缺失。但由于本研究Y染色體微缺失組樣本量小，比較結果可能存在偏差，還有待擴大樣本量做進一步的研究。因Y染色體微缺失患者未行植入前遺傳學診斷（PGD）技術進行性別篩選，也就存在將微缺失垂直傳遞給子代男嬰以及將來男嬰成人后依舊面臨Y染色體微缺失乃至不育的風險。該結論與國內外大部分文獻報道相一致［19-20］。

Y染色體微缺失能夠引起生精功能障礙造成少、弱精子癥甚至無精子癥，繼而造成男性不育癥的發生，但同時這種缺失不會傳遞給子代。而隨著ICSI技術的產生、發展，由Y染色體微缺失引起的少精子癥及無精子癥均可以通過ICSI技術獲得自己的子代，若獲得的子代為男嬰，這種微缺失就會垂直傳遞給子代，甚至有研究顯示這種微缺失在男性子代成長過程中會擴大缺失片段，造成子代男性延續不育現象。為了避免此類情況的發生，就需要對該類微缺失患者進行PGD技術，俗稱“三代試管嬰兒”，它能夠在胚胎植入母體前對胚胎進行篩選，選擇沒有Y染色體的胚胎，這樣得到的女性后代就可以成功阻斷微缺失的繼續遺傳。對于男方有Y染色體微缺失欲行ICSI助孕的夫婦，需告知若為男性后代成年后同樣面臨生育問題，但不影響健康［21］。經過充分的遺傳咨詢，絕大部分夫婦仍然選擇行常規ICSI，理論上生育男性后代的概率為50%，少部分夫婦選擇PGD挑選女性胚胎移植或供精人工授精。但對這類患者是否需要行PGD一直以來備受爭議，因為PGD技術不僅費用昂貴，且有可能無法篩選出合適的胚胎，這樣的結果往往讓患者難以接受。這也是目前國內外對于PGD這項技術爭論的焦點之一。