MiR-155及其靶基因MMP16在反復植入失敗患者子宮內膜中的表達*

李偉偉，于濤，劉聰，董麗霞，李剛，閆婭妮，殷秀榮（.秦皇島市婦幼保健院生殖醫學科，河北秦皇島066004；.濰坊醫學院生命科學與技術學院，山東濰坊6053）

隨著輔助生殖技術的發展，優質胚胎的利用率和臨床妊娠率已得到提升，但是有些優質胚胎仍未能著床。胚胎成功植入子宮內膜主要有幾方面影響因素：胚胎因素、子宮內膜的容受性以及胚胎和內膜之間的同步性［1］。子宮內膜的容受性對于胚胎的成功植入起關鍵作用。研究表明，2/3的反復植入失敗（repeated implantation failure，RIF）患者是由于內膜的不容受性引起的［2］。近年來，子宮內膜的容受性成為學者的研究熱點。miRNA是一種非編碼RNA，結構高度保守，長約20個核苷酸，存在于多種組織和細胞，是一種轉錄后水平調控基因表達的轉錄后調節因子。研究表明，miRNA參與胚胎著床、子宮內膜異位癥、反復種植失敗、復發性流產等過程［3-7］，影響著胚胎黏附、植入、子宮內膜蛻膜化等多種與子宮內膜容受性緊密相關的重要的生命活動過程。高玲等［8］研究發現，子宮內膜異位癥患者子宮內膜中miR-155表達高于正常子宮內膜，且miR-155的表達能夠調控子宮內膜間質細胞增殖與凋亡。明琪［9］研究表明，miR-155在正常子宮內膜的分泌中期低表達，參與胚胎植入和內膜的蛻膜化過程。金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一種能夠降解細胞外基質的蛋白質水解酶。MMP在多種生物過程中都發揮重要作用，包括細胞的增殖和分化、子宮內膜的容受性、腫瘤的血管生成等［10-12］。本研究主要探討miR-155及其靶基因MMP16在RIF患者子宮內膜的表達情況。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2018年5月至2019年12月在秦皇島市婦幼保健院生殖醫學科進行體外受精與胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）或者卵細胞質內單精子注射（intracytoplasmic sperm microinjection，ICSI）治療的不孕患者，其中由于男方因素或者輸卵管因素于我科首次進行IVF-ET或ICSI助孕后妊娠并分娩的患者15例作為對照組，年齡23～37歲；至少進行3次移植（新鮮或者解凍的胚胎，每次至少有一枚優質胚胎，移植優質胚胎數≥4）均未妊娠的患者15例作為RIF組，年齡23～37歲。所有研究對象均采用常規的長方案進行控制性超促排卵。納入標準：①符合不孕癥的診斷標準［13］；②年齡23～37歲；③進行3次及以上取卵周期，且每個周期有一個優質胚胎移植而未孕；④基礎內分泌正常，且有正常月經周期；⑤進入周期前6個月未進行過宮腔操作或使用激素類藥物。排除標準：①宮腔異常形態；②染色體異常或其他遺傳因素引起的反復植入失敗；③既往有影響卵巢反應性的疾病，如早發性卵巢功能不全、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征；④子宮內膜異位癥患者；⑤可移植的優質胚胎（7細胞以上，碎片＜10%的卵裂胚，或者4BB、5BB的囊胚）≤3個；⑥有傳染性疾病；⑦輸卵管積水。本研究經秦皇島市婦幼保健院倫理委員會討論通過（批準文號為：秦倫字20180523號），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 Genesy40/50紫外分光光度計（美國賽默飛世爾公司）；7500實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（美國應用生物系統公司）。

人子宮內膜癌細胞株（HEC-1A）購自上海中科院細胞庫；DMEM培養基和胎牛血清購自美國HyClone公司；胰蛋白酶購自美國GiBCO公司。miR-155模擬物（miR-155 mimics）、miR-155抑制物（miR-155 inhibitor）、無關序列（模擬物對照，抑制物對照）以及相關引物均購于沈陽萬類生物公司；高純miRNA提取試劑盒購于瑞士Roche公司；Lipofectamine2000購于沈陽萬類生物科技公司；熒光定量PCR試劑盒購于ThermoFisher公司；pmir-GLOVector質粒購于上海捷瑞生物工程公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒以及MMP16抗體（ab73877）、β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗均購自Abcam（上海）公司。

1.3 內膜標本的采集 所有研究對象均在進入治療周期前一個月經周期的第21～22天（LH峰的第7天或排卵后第6天）體內行宮腔鏡取內膜或者子宮內膜刺激時留取。將內膜一式2份，一份送病理科用于切片和免疫組化的檢查，一份保存于液氮中用于mRNA和蛋白質印跡的檢測，并收集取內膜日的空腹靜脈血2 mL，離心后留取上清液，保存于-20℃待用。

1.4 細胞培養與轉染 將人子宮內膜癌細胞株（HEC-1A）接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞生長到80%融合時，加入胰蛋白酶消化，傳代，取對數生長期的細胞采用Lipofectamine2000試劑盒進行轉染（嚴格按照試劑盒操作規程完成），轉染24 h后收集細胞進行各項檢測。在轉染miR-155的實驗中，分為miR-155模擬物組、miR-155抑制物組以及各自對照組。

1.5 qRT-PCR檢測miR-155以及MMP16 mRNA的表達 采用高純miRNA提取試劑盒提取總RNA，參照反轉錄試劑盒得到cDNA，然后以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增反應。嚴格按照SYBR Green qPCR試劑盒進行操作，反應體系：SYBR Premix ExTaqII（2×）10μL，cDNA 2μL，4μmol/L上、下游引物各0.5μL，dH2O補足體系至20μL；反應條件為：95℃5 min，循環1次；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共循環40次。miR-155以U6為內參，采用2△△Ct法計算miR-155的相對表達量。根據NCBI中MMP16和miR-155的序列號（Gene ID：4325和Gene ID：406947），利用Primer primer 5.0軟件進行引物設計，均由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列及擴增長度

1.6 雙熒光素酶報告基因系統驗證miR-155對MMP16的調控作用 通過生物信息學手段，根據Targetscan、DB、starbase、tarbase來預測miR-155的潛在靶點，分析結果發現MMP16 mRNA的3′UTR區為miR-155的潛在靶點。將含有miR-155結合位點在內的MMP16 3′UTR區進行PCR擴增，然后將擴增片段插入到pmirGLO載體中，載體命名為pmirGLO-MMP16-wide type（MMP16-3′UTR-WT）；設計針對MMP16 3′UTR“種子區”的突變引物，插入到pmirGLO載體多克隆位點中，載體命名為pmirGLO-MMP16-mutant（MMP16 3′UTR-Mut）。所有關于載體和報告基因的轉染均由沈陽萬類生物公司完成。MMP16 3′UTR-WT、MMP16 3′UTR-Mut分別與miR-155模擬物、miR-155抑制物以及各自的對照（mimics control、inhibitor control）兩兩組合共轉染到HEC-1A細胞中。轉染后48 h，收集HEC-1A細胞進行各組細胞螢火蟲螢光素信號及海腎螢光素信號的檢測，實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測MMP16蛋白表達水平 采用RIPA裂解緩沖液（Beyotime）按照標準操作從組織和細胞中提取總蛋白質。采用BSA法測定蛋白濃度，根據吸光度（A595nm）值從標準曲線中計算蛋白質的濃度。根據蛋白質濃度計算上樣量。本研究實驗的樣品量為20μL，上樣量為30μg。臨用前加入樣品緩沖液：2%十二烷基硫酸鈉、100 mmol/L二硫蘇糖醇、60 mmol/L Tris（pH 6.8）、0.01%溴酚藍和10%甘油。在電極（正極）上依次疊放PVDF膜和凝膠。轉膜結束后，將膜浸入封閉液（含5%脫脂奶粉的TBS）中緩慢振蕩后洗滌；加入兔抗人MMP16抗體（批號ab73877），4℃緩慢振蕩過夜；加HRP標記的二抗（1∶10 000稀釋），室溫緩慢振蕩2 h后洗滌；以β-action作為內參，采用Quantity One軟件將條帶轉化為灰度值，蛋白質表達量=目的條帶灰度值/內參條帶灰度值。

1.8 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），相關分析采用Pearson相關；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料的比較 比較RIF組和對照組的年齡、不孕年限、BMI、不孕因素、不孕類型、受精方式，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 RIF組和對照組一般資料的比較（±s）

表2 RIF組和對照組一般資料的比較（±s）

指標 RIF組（n=15）對照組（n=15） F（χ2）值 P值年齡（歲） 33.45±1.24 32.76±1.95 1.156 0.257不孕年限（年） 3.82±0.69 4.23±0.75 1.558 0.130 BMI（kg/m2） 23.13±2.47 23.78±1.96 0.798 0.431不孕類型［n（%）］ 原發 7（46.67） 6（40.00） 繼發 8（53.33） 9（60.00） 0.136 0.713不孕因素［n（%）］ 男方因素 4（26.67） 5（33.33） 輸卵管因素 7（46.67） 6（40.00） 男方+輸卵管因素 4（26.66） 4（26.67） 0.188 0.910受精方式［n（%）］ IVF 9（60.00） 7（46.67） ICSI 6（40.00） 8（53.33） 0.536 0.464

2.2 RIF組和對照組控制性促排卵及移植日內膜厚度的情況 比較RIF組和對照組HCG日的E2、P以及獲卵數、Gn用量、Gn天數、移植日內膜厚度，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 兩組患者控制性促排卵情況的比較（±s）

表3 兩組患者控制性促排卵情況的比較（±s）

分組 HCG日E2（pmol/L）HCG日P（nmol/L）獲卵數（個） Gn用量（IU） Gn天數（d）移植日內膜厚度（mm）RIF組（n=15） 10 798.54±453.79 2.53±0.98 12.45±2.01 2 109.84±389.05 12.45±1.08 11.12±1.90對照組（n=15） 10 953.74±892.53 2.41±1.05 11.78±1.96 1 980.37±562.86 13.67±2.14 11.85±2.13 t值 0.600 0.324 0.924 0.733 1.971 0.991 P值 0.553 0.749 0.363 0.470 0.058 0.330

2.3 RIF患者內膜組織miR-155的表達水平 RIF組子宮內膜miR-155的表達水平（1.28±0.08）高于對照組（0.33±0.03），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 MiR-155調控MMP16的表達 雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-155模擬物和MMP16 3′UTR-WT共轉染HEC-1A細胞后，細胞的熒光信號與對照組比較明顯受到抑制；miR-155抑制物和MMP16 3′UTR-WT共轉染HEC-1A細胞后，細胞的熒光信號與對照組比較，明顯增強。miR-155模擬物或者miR-155抑制物共轉染MMP16 3′UTR-Mut后，熒光信號與對照組比較沒有明顯變化（P＞0.05），見圖1。進一步的實驗結果表明，轉染miR-155模擬物能夠下調MMP16的mRNA和蛋白質的表達水平；轉染miR-155抑制物能夠上調MMP16的mRNA和蛋白的表達水平，結果與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 MiR-155對HEC-1A細胞的MMP16基因表達的靶向抑制

圖2 轉染miR-155對HEC-1A細胞中MMP16基因和蛋白質表達的影響

2.5 RIF組和對照組子宮內膜MMP16 mRNA和蛋白質的表達情況 RIF組MMP16 mRNA的表達水平（2.11±0.15）低于對照組（3.02±0.06），差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步的Western blot實驗結果顯示，RIF組MMP16蛋白的表達水平（0.43±0.07）低于對照組（0.97±0.03），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 RIF組和對照組子宮內膜MMP16的表達情況

2.6 RIF患者子宮內膜中miR-155和MMP16相關性分析 經過Pearson相關性分析，RIF患者子宮內膜miR-155和MMP16蛋白的表達水平呈負相關（r=-0.976，P＜0.05）。

3 討論

胚胎成功植入是生殖醫學領域的研究熱點。子宮內膜在胚胎植入時有一個短暫的容受性良好的窗口期，此時期在各種激素的協調控制下，內膜經歷一系列的周期性改變。一般在排卵后6～8 h，子宮內膜最適應胚胎的植入［14］，否則容易引起植入失敗。因此，準確判斷窗口期及種植窗口期子宮內膜調控的分子機制就變得越來越重要。miRNA的異常表達對反復流產、胚胎著床、胚胎早期發育、子宮內膜容受性等方面均有影響。紀娜等［15］研究表明，miR-155的表達及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP2和MMP9的表達量對子宮內膜細胞的生長有著顯著的影響。Drissennek等研究了RIF患者移植窗口期子宮內膜miRNA的差異表達譜，結果發現miR-155和miR-152與植入失敗相關，并經過驗證［16］。Chen等［17］證實整合素連接激酶低表達通過失活Wnt/β-catenin信號傳導并降低MMP-3/9表達而降低了子宮內膜的容受性。

本研究通過生物信息學、雙熒光素酶實驗和轉染實驗證實miR-155通過與MMP16 3′UTR結合，從而抑制MMP16 mRNA的表達。RIF組MMP16 mRNA的表達水平低于對照組（P＜0.05），RIF患者的MMP16與miR-155的表達水平呈負相關（P＜0.05）。MMP16是一種金屬基質蛋白，在細胞的增殖、分泌及內膜的容受性等方面均發揮重要作用，miR-155對子宮內膜容受性的調節作用可能是通過下調MMP16的表達而發揮作用。在臨床工作中，我們可以通過miR-155和MMP16在內膜上的表達情況預測反復種植失敗的情況，從而節省胚胎、減輕患者心理負擔。本課題主要研究miR-155在RIF患者內膜的表達，在分子機制的層面研究子宮內膜容受性的調控，以尋求改善容受性的策略，提高輔助生殖技術（ART）的成功率和胚胎利用率。而IVF-ET或者ICSI周期的患者除進行控制性促排卵外，移植后需要進行黃體支持，我們的研究結果只能表明RIF患者的基礎狀態下的內膜miR-155和MMP16表達情況與反復植入失敗的關系。盡管與控制性促排卵周期相比，自然周期中的子宮內膜發育可能涉及不同的基因表達模式，但子宮內膜生物標志物的測定可能有助于預測較低的受孕機會，為患者咨詢、子宮內膜準備和凍融胚胎移植提供基礎。

本研究初步發現miR-155與RIF相關，而miR-155調控RIF的可能機制是通過調節MMP16基因表達實現。下一步的研究需要更深入地采用功能性的實驗來確定miR-155如何調控子宮內膜的容受性。由于我們的樣本量不足，研究可能存在一定的偏倚。但是仍然希望這項研究能夠對輔助助孕周期中發生RIF的風險做出預測，并為臨床治療提供更為科學的指導。