胚胎植入前遺傳學檢測技術在環狀染色體攜帶者助孕中的應用價值*

陳虹，解洪強，趙麗娟，劉曉丹，劉敏，傅海龍，劉燕，邱松，高選（山東大學附屬生殖醫院，濟南250021）

胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是在胚胎移植之前通過對配子或胚胎進行遺傳學分析，從而選擇植入未見異常的胚胎，以提高著床率和活產率［1］。PGT包括非整倍體植入前基因檢測（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A）和植入前結構重排基因檢測（preimplantation genetic testing for structural rearrangement，PGT-SR），其中PGT-SR是針對染色體異常的夫婦在植入胚胎前檢測易位染色體的不平衡胚胎和非整倍體胚胎，以降低流產風險［2］。

環狀染色體（ring chromosome）是一種環狀DNA分子，在真核生物中發生頻率較低，大約為1∶50 000［3］。研究發現，環狀染色體在胚胎發生過程中常會導致各種表型，主要是伴隨著缺失和重復引起［4］。Mantzouratou等［5］用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測1例環狀22號染色體攜帶者的胚胎，在12枚胚胎的卵裂球中僅有1枚被診斷為未見異常胚胎，但此胚胎未發育到囊胚期。FISH只能檢測有限數量的染色體［6］且活檢時期在卵裂階段，其空間分辨率受雜交失敗或信號重疊、散射等因素影響［7-9］，諸多因素會影響其結果準確性。二代測序技術（next generation se-quencing，NGS）逐漸應用于臨床，其不僅能夠同時分析所有染色體，還能夠檢測染色體非整倍體異常，具有檢測效率高、通量高、分辨率高、檢測成本低等優勢。

為獲得胚胎植入前遺傳學篩查技術在環狀染色體患者助孕中的臨床診斷價值，本研究回顧性分析1例環狀染色體攜帶者，為臨床環狀染色體的遺傳咨詢提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 患者女，30歲，2012年結婚，性生活正常，未采取避孕措施，5年未孕。2016年期間采用指導同房和體外授精助孕，均未孕。2017年10月于我院行供精人工授精（artificial insemination with donor semen，AID）未孕后檢測夫妻雙方染色體并要求行PGT助孕。本研究方案已通過山東大學附屬生殖醫院醫學倫理委員會批準，批準文號：［2020］倫審字（3）號，患者簽署了知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 1640培養基、秋水仙素（杭州浩仁醫藥公司）；Gsl-120自動掃描儀（德國Leica公司）；全基因組擴增試劑盒、Veriseq DNA Library文庫構建試劑盒、Miseq Reagent Kit測序試劑盒、Miseq測序平臺（美國Illumina公司）。

1.3 外周血染色體核型分析 無菌條件下采集患者4 mL外周血，用1640培養基37℃恒溫培養68～72 h；用1 mL注射器垂直加入60μL 40μg/mL秋水仙素，繼續培養1.5 h后進行細胞收獲；常規G顯帶后在Gsl-120自動掃描儀掃描分析，計數20個中期分裂相，分析5個。

1.4 胚胎植入前遺傳學檢測

1.4.1 囊胚活檢 患者在第1周期采用長效促性腺激素釋放激素激動劑（gonadropin releasing hormone agonist，GnRH-a）方案，第2周期使用拮抗劑方案進行卵巢刺激，卵母細胞均采用胞質內單精子注射授精，胚胎采用玻璃化冷凍保存。對培養到囊胚期的胚胎，在滋養外胚層活檢3～5個細胞，活檢后將細胞立即放入2.5μL 1×PBS的PCR管中，如不能立即檢測則-20℃凍存［10］。

1.4.2 遺傳學檢測 活檢后的細胞使用Sureplex方法進行全基因組擴增。全基因組擴增后的DNA經酶切打斷后形成小的DNA片段，加入文庫構建試劑盒內的T4聚合酶將DNA片段末端補平，增加一個腺嘌呤脫氧核苷酸。隨后T4 DNA連接酶通過TA連接法將測序通用引物與末端補平后的DNA連接，完成文庫構建。構建好的文庫分子與測序芯片表面的共價結合的引物互補配對，固定到芯片表面，通過橋式PCR擴增形成DNA序列片段，基于可逆末端終止法和邊合成邊測序的化學原理，讀取DNA片段的序列數據，最終使用BlueFuse Multi進行數據分析來獲得樣本染色體拷貝數的評價結果。

1.5 胚胎移植 胚胎發育至囊胚期，根據卵裂球大小、規則性、胞質折光性和碎片多寡等形態學指標評估胚胎的質量，結合NGS檢測結果，選擇1個形態學較好且染色體整倍性的胚胎植入母體子宮，其余符合凍存條件的胚胎冷凍保存。

2 結果

2.1 夫妻雙方外周血核型結果 女方外周血核型結果為：46，XX，r（22）（p11.2q13）；男方核型結果為：45，XY，der（13；14）（q10；q10）。見圖1。

圖1 染色體核型結果

2.2 胚胎檢測結果 經NGS檢測后，患者第1周期1枚胚胎為非整倍體胚胎，第2周期有2枚胚胎為非整倍體胚胎，2枚胚胎為整倍體胚胎。非整倍體胚胎檢測結果均為21號染色體單體。見圖2。

圖2 胚胎檢測結果

2.3 胚胎移植、產前診斷及妊娠結局 患者選擇第2周期的1枚整倍體胚胎進行植入，植入后獲臨床妊娠，隨訪其產前診斷結果為46，XN，r（22）（p11.2q13），見圖3。最終獲活產女嬰，表型正常。

圖3 產前診斷羊水核型結果

3 討論

本文通過對1例22號環狀染色體攜帶者家系進行回顧性研究，使用NGS排除了非整倍體胚胎以后，移植整倍體胚胎后獲得了健康女嬰。這是首次用NGS在胚胎植入前對環狀染色體的家系進行篩查，也是首次通過PGT篩查后獲得未見異常胚胎且活產的報道。

本研究中，共檢測了5枚胚胎，其中有3枚胚胎為非整倍體，異常率為60%，且非整倍體結果均為22號單體，說明在減數分裂的過程中，環狀染色體會發生丟失的情況。如果患者未進行PGT檢測，至少移植3次才能獲得正常胎兒的活產，PGT能夠排除60%的非整倍體胚胎，這個異常率要明顯低于之前報道的12個卵裂球中僅有1個正常的概率［5］，出現這種情況的原因可能有2個：一是之前報道中使用樣本為卵裂球，本研究中使用囊胚滋養外胚層細胞，可能在胚胎發育過程中會有一部分非整倍體被淘汰［11］；二是之前的報道中使用的方法為FISH，本研究中使用NGS方法進行檢測，FISH的準確性在之前研究中其誤診率較高［12］。

本研究中移植的未見異常胚胎產前診斷結果為22號環狀染色體，并未見到22號染色體的片段缺失，可以推斷患者環狀染色體形成的模式是由22號染色體端粒連接而形成，根據之前的報道這種形成方式未造成遺傳物質的丟失［13］。此種情況下環狀染色體的攜帶者通常為正常的，其攜帶狀態的發現主要是在接受檢查時發現，如妊娠失敗或子女異常時［14-16］。本研究對象表型正常，因多年未孕進行染色體檢測，與之前報道相符。

環狀染色體在有絲分裂過程中是不穩定的，經常會導致嵌合體和生長緩慢［17］。但在本研究中，女方攜帶者及其子代羊水穿刺結果顯示均未有嵌合體的情況發生。在之前關于22號環形染色體的報道中也很少有嵌合體發生［18-19］。因此，環狀染色體在有絲分裂過程中產生嵌合體的原因還有待進一步闡明。

NGS技術雖能排除非整倍體胚胎，但依然無法分辨正常胚胎和環狀染色體攜帶型的胚胎。因此，建議患者在進行了胚胎植入前遺傳學檢測后，依然需要進行羊水穿刺確認。

本文患者為女性攜帶者，在之前研究中顯示男性攜帶者遺傳給子代的報道非常罕見。因此，男性攜帶者是否需要進行胚胎植入前遺傳學篩查還需進一步研究。

綜上所述，環狀染色體攜帶者會產生異常胚胎，在進行胚胎植入前遺傳學檢測后，可以排除非整倍體胚胎，獲得健康胎兒。但在獲得臨床妊娠后需進行羊水穿刺核型檢測確認子代核型。