無頭精子癥的表型、遺傳學分析與治療策略*

李維娜，劉剛，張歡，朱文兵（1.湖南光琇高新生命科技有限公司，長沙10001；2.中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院男科學部，長沙10081；3.湖南省生殖與遺傳臨床醫(yī)學研究中心，長沙10081；.中南大學基礎醫(yī)學院生殖與干細胞工程研究所，長沙10081）

無頭精子癥（acephalic spermatozoa），又被稱為斷頭精子癥（decapitated spermatozoa或decaudated spermatozoa）或大頭針樣精子癥，指精液中大部分精子呈現(xiàn)精子頭部缺失、頭部與尾部斷開或松散連接。無頭精子癥是導致男性不育的原因之一，幾乎不可能通過自然妊娠的方式獲得后代。關于無頭精子癥遺傳學病因分析的報道較少，SUN5［1-2］、PMFBP1［3-4］、TSGA10［5-7］、BRDT［8］基因突變可導致無頭精子癥。目前對不同致病基因不同位點變異導致的無頭精子癥的臨床表型與治療策略尚無深入研究。本研究招募了10例嚴重無頭精子癥患者，通過全外顯子組測序對其進行遺傳學分析，并對每種突變類型的精子形態(tài)表型進行細致劃分，為今后無頭精子癥的治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2020年1至12月于中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院就診的嚴重無頭精子癥患者10例，按《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）評估特異性精子缺陷。納入標準：（1）婚后同居1年以上，性生活正常，未采取避孕措施的不育男性；（2）資料完整；（3）已找到已知致病基因的變異（包括文獻已報道的和我們新發(fā)現(xiàn)的）；（4）嚴重無頭精子癥（單一畸形率＞70%）。排除標準：（1）染色體核型異常；（2）Y染色體微缺失；（3）未找到已知無頭精子癥相關基因的變異。本研究獲得中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院倫理委員會批準（批準文號：LL-SC-2019-018），所有納入研究對象均被告知本研究的目的以及外周血、精液去向，并簽署了知情同意書。

1.2 標本采集與處理

1.2.1 外周血標本采集 采集研究對象靜脈血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，-80℃保存。

1.2.2 DNA抽提 取外周血200μL，用外周血DNA抽提試劑盒（GIAGEN）提取基因組DNA，按說明書操作。用Nanadrop2000檢測DNA濃度及純度。

1.2.3 精液標本采集 采集精液樣本前禁欲2～7天，手淫法獲取全部精液于無菌廣口采精杯中。采精杯注明姓名，檢驗申請單上注明采集日期和時間、未射精天數(shù)，立即放入37℃恒溫箱內(nèi)。待精液完全液化后進行檢測。報告中注明樣本采集是否完整，尤其注明是否有富含精子的射精最初部分丟失。如有丟失應在禁欲2～7 d后再次采集精液做進一步檢測。

1.3 精液常規(guī)分析 按照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）進行操作。先用肉眼觀察精液標本的量、顏色、黏稠度及是否液化。如標本已經(jīng)液化，用pH試紙測其pH值。將完全液化后的精液充分混勻，用移液槍吸取3μL精液于一次性精子檢測板（賽司醫(yī)療科技北京有限公司）中，采用全自動精子質量分析儀（賽司醫(yī)療科技北京有限公司）對精子濃度、活力等參數(shù)進行分析，人工鏡檢采用Makler計數(shù)板（以色列Sefi-medical instruments公司）。精液參數(shù)參考區(qū)間：精液量≥1.5 mL，精子濃度≥15×106/mL，前向運動精子百分率（PR）≥32%，精子活動率≥40%。

1.4 精子巴氏染色 將完全液化后的精液充分混勻，滴10μL精液于潔凈的載玻片上，以45°、1 s的速度刮片，待其自然干燥。根據(jù)《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）提供的改良巴氏染色方法配制染液（蘇木素染色液、EA50染液、橘黃G染液均購自BASO公司）并染片。

1.5 臨床資料收集 收集患者的基本資料（性別、年齡、配偶年齡、配偶病史、雙方生育史、吸煙嗜酒史、遺傳性疾病家族史、全身慢性疾病病史、性功能障礙病史、大量吸煙飲酒和長期接觸有害物質史、精索靜脈曲張、生殖系統(tǒng)器質性病變、生殖道感染等）；收集患者配偶的實驗室及臨床結局（助孕方式、卵母細胞總數(shù)、MⅡ期卵母細胞數(shù)、受精卵母細胞數(shù)、優(yōu)質胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、臨床妊娠結局）。

1.6 遺傳學分析

1.6.1 全外顯子組測序 收集患者外周血gDNA樣本送武漢華大公司進行全外顯子組測序（WES）。用Agilent SureSelect version 6捕獲外顯子，采用BGISEQ-500平臺測序，測序深度＞100×，Q30≥80%。測序得到的原始數(shù)據(jù)使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）v0.7.15和GATK軟件進行序列比對和變異識別，用ANNOVAR工具對變異進行注釋。過濾篩選樣本中的單核苷酸位點變異（single nucleotide variants，SNV）、插入和缺失（insertion-deletion，InDel）：（1）過濾掉ExAC、1000Genomes和gnomAD、dbSNP數(shù)據(jù)庫中＞1%的變異；（2）保留位于外顯子區(qū)（錯義、無義、移碼）和剪切區(qū)位點的變異；（3）去掉同義突變（synonymous SNV）；（4）保留ClinVar數(shù)據(jù)庫中注釋為“Pathogenic”或“Likely pathogenic”的位點；（5）保留ClinVar、OMIM、HGMD、文獻中已報道與無頭精子癥相關的致病基因突變位點；（6）在小鼠/人睪丸組織中特異性高表達的純合或雙等位基因雜合突變。

1.6.2 Sanger驗證 根據(jù)SUN5（NM_080675.3）、TSGA10（NM_025244.2）、PMFBP1（NM_031293.2）基因序列（GRCh37/HG19），用在線Primer 3.0（http：//primer3.ut.ee）軟件設計引物。對候選致病突變位點所在基因組區(qū)域進行PCR擴增，純化PCR擴增產(chǎn)物，送長沙擎科公司進行雙向Sanger測序驗證。

1.7 精子表型分析 由同一專業(yè)檢驗人員嚴格按照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）形態(tài)學分類標準進行精子形態(tài)學分析，在油鏡下計數(shù)至少200個精子，計算正常形態(tài)精子百分率、異常形態(tài)精子百分率、頭部缺陷率、主段缺陷率、尾部缺陷率。

1.8 ICSI治療 通過陰道B超及血清雌二醇（E2）水平監(jiān)測卵泡發(fā)育，卵泡發(fā)育成熟后肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），36 h后在B超引導下取卵，取卵4～6 h后行卵細胞質內(nèi)單精子注射（ICSI）。男性取精前禁欲2～7 d，采用直接洗滌法優(yōu)化處理精液，由于這些患者精子的頭尾部連接非常脆弱，實驗室工作人員在ICSI操作中必須非常小心（避免造成精子頭尾分離），將完整精子注入卵母細胞；如果未找到完整的精子，則將分離的精子頭部和尾部全部注入MⅡ卵母細胞，授精后16～18 h觀察受精情況。根據(jù)Racowesky法對胚胎進行評級，D3卵裂球≥6的Ⅰ～Ⅱ級胚胎為優(yōu)質胚胎；根據(jù)患者胚胎和子宮內(nèi)膜情況取卵后3 d選擇1～2個新鮮優(yōu)質胚胎移植，移植后行黃體支持。移植35 d后B超下見孕囊及原始心管搏動為臨床妊娠。

2 結果

2.1 精液分析和分子遺傳學分析 在10例嚴重無頭精子癥患者（表1）中，鑒定到3個基因SUN5、TSGA10、PMFBP1的11種純合或雜合變異（表2）。

表1 嚴重無頭精子癥患者的精液分析

表2 嚴重無頭精子癥患者的致病變異和臨床妊娠結局

2.2 精子表型分析 無頭精子主要有2個亞型［5］：一種是沒有核物質的小針頭端；另一種是頭部-中段連接錯位的精子［9-10］。我們對10例嚴重無頭精子癥患者的精子形態(tài)進行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)：（1）即使是同一位患者的無頭精子都有多種形態(tài)，在2種主要亞型的基礎上，不同精子在結構上有許多細微的差異（例如：尾部結構的部分缺失、尾部頂端有殘留的胞質小滴、無頭尾部、無尾頭部、松散的頭部、頭頸部連接錯位等）；（2）不同的致病基因（SUN5、TSGA10、PMFBP1）變異可產(chǎn)生類似的無頭精子癥表型；（3）同一個致病基因不同位點的變異產(chǎn)生的無頭精子癥表型沒有明顯差異，但在細微結構和所占比例上會有區(qū)別；（4）無頭精子癥的基因型（指本研究涉及的SUN5、TSGA10、PMFBP1三個基因，其他基因的情況還有待研究）與巴氏染色表型（不包括透射電鏡）沒有明顯的相關性。

2.3 ICSI妊娠結局分析 10例患者ICSI治療周期的結果見表2。除P9患者未進周期外，其他9例患者的受精率為85.79%（169/197），優(yōu)胚率為55.03%（93/169），妊娠率為66.67%（6/9）（3位患者P1、P5、P6未妊娠）。其中P1配偶年齡為51歲，僅獲卵1枚，沒有可移植胚胎。

圖1 10例嚴重無頭精子癥患者的精子表型

3 討論

根據(jù)精子的超微結構和遺傳學變異，可將無頭精子的頸部斷裂點分為3個亞型［4，11-12］（圖2）：（1）亞型Ⅰ的斷裂點在2個中心粒之間。無尾頭部連接到完整的近端中心粒［10，13］，具有完整的植入窩和基底體［13-15］。（2）亞型Ⅱ的斷裂點在細胞核和近端中心粒之間，無尾頭部缺乏植入窩和/或基底體，存在完整的近端和遠端中心粒［2-3，15-18］。SUN5、HOOK1、PMFBP1基因突變與該類缺陷有關［2-3，16］。（3）亞型Ⅲ的斷裂點在遠端中心粒和精子中段之間，在精子尾部的近端可觀察到胞質小滴，有/無不完整的線粒體鞘。TSGA10、BRDT基因突變與該類缺陷有關。但通過精子巴氏染色并不能有效區(qū)分這3種亞型。精子的中心粒如果不能正常遷移和附著在精子細胞核的尾極，則精子頭部和尾部會分別獨立發(fā)育，產(chǎn)生缺乏頭部或頭部-中段排列異常的精子、無頭尾和松散的頭部［19-20］。松散的精子頭部在我們的研究中并不常見，因為它們通常都被支持細胞吞噬［20-21］。

圖2 無頭精子癥相關基因和亞型的模式圖［11］

SUN5蛋白定位于精子頭尾連接處的植入窩和核膜上，可能參與頭尾黏連作用（將耦合裝置與精子頭部細胞核膜連接）；PMFBP1蛋白定位于SUN5所在位置和節(jié)柱、小頭之間，包含有染色質交聯(lián)活性的重要功能結構域Smc；TSGA10蛋白定位于中心粒區(qū)域且可能參與中心粒功能。許多研究者認為，父系遺傳的中心粒在胚胎發(fā)育中是必不可少的，因此導致精子沒有近端中心粒的TSGA10突變會影響ICSI治療中早期胚胎的發(fā)育［9，20，22］。但在本研究中，9例患者的受精率為85.79%，優(yōu)胚率為55.03%，妊娠率為66.67%；10例患者有3例為TSGA10突變（P2、P3、P4），均已成功生育子代；且P3、P4、P8多年前已在我院通過ICSI成功生育第一胎，現(xiàn)為生育二胎再次來我院行ICSI治療。分析P5、P6失敗原因可能為子宮腺肌癥、宮腔粘連術后、胰島素抵抗等。因此，我們認為ICSI的成功率與患者攜帶的無頭精子缺陷相關基因（TSGA10、SUN5、PMFBP1）變異、形態(tài)學表型無關。不同遺傳變異引起的無頭精子缺陷可能只影響精子形態(tài)，ICSI注入松散的精子頭部或頭尾連接異常的精子，均可以獲得較為理想的受精率，并不影響早期胚胎質量和臨床妊娠。同時，導致植入失敗的女性因素不容忽視。

我們認為在治療無頭精子癥時應注意以下幾點。首先，ICSI可用于治療無頭精子癥。成熟的精子頭部在射精或獲能后從尾部脫落。如果患者射出精液中沒有精子頭部，可從睪丸中收集精子來進行ICSI。第二，即使患者的正常形態(tài)精子百分率是0，100%的精子都是無頭精子，仍然可以找到幾個有完整頭部的精子或松散的無尾精子頭部。第三，確定高比例和單一類型精子畸形患者無頭精子癥相關的基因變異和形態(tài)學亞型在臨床上仍然有一定意義。第四，應謹慎對待該實驗結果，本研究涉及TSGA10、SUN5、PMFBP1三個基因，不可外推至其他基因。第五，在雙等位雜合子/純合子突變的無頭精子患者及其配偶中篩選這些已知的致病基因，以避免將突變傳遞給后代。第六，如果配偶同時攜帶突變，在ICSI移植時可考慮優(yōu)先女性胚胎［3，23］，盡管ICSI可以解決無頭精子癥患者的生育問題，男性胚胎有50%的機會在成年后面臨與父親相同的不育問題。

綜上所述，ICSI可用于治療無頭精子癥，不同基因變異引起的無頭精子缺陷可能只影響精子形態(tài)，可以獲得較為理想的受精率。本研究的患者數(shù)量相當有限，仍有待進一步的全面研究，為今后無頭精子癥的治療提供參考策略。