卡托普利對肝纖維化大鼠肝功能及肝組織α-SMA、Ⅰ型膠原的影響*

王曉露，張 坤，曾慶鑫，胡 海，孫 潔

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院2017級研究生，內蒙古 包頭 014060；2.內蒙古科技大學包頭醫學院病理生理學教研室；3.內蒙古包鋼醫院)

肝纖維化是肝組織在多種損傷因素作用下發生細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的慢性增生，隨著時間的推移，逐漸形成慢性肝損傷[1]，如果任其發展，可導致肝功能衰竭、門靜脈高壓征和肝癌等。肝纖維化發生機制包括激活的肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)產生ECM、氧化損傷和凋亡、炎癥等。靜止的HSC在受到大量生長因子和缺氧產生的促炎性介質刺激后，將轉變為成纖維細胞，成纖維細胞能夠產生大量Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)等ECM成分[2]。因此，抑制HSC的激活和collagen Ⅰ的合成是治療肝纖維化的方向之一。

已有文獻報道，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)能夠激活HSC并增加轉化生長因子β(Transforming growth factor beta，TGF-β)所有亞型的mRNA表達水平，提示抑制Ang Ⅱ的合成可能成為治療肝纖維化的一個研究切入點[3]。作為血管緊張素轉換酶抑制劑(Angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)的藥物卡托普利，具有抑制Ang Ⅱ合成的作用，但是其能否通過抑制HSC的活化，進而改善肝功能，目前還未見報道。

本研究對肝纖維化大鼠進行卡托普利治療，旨在探討卡托普利在肝纖維化的治療中的作用及其機制，為臨床上肝纖維化的治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1實驗動物 5～6周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體重180～220 g，由北京市斯貝福生物技術有限公司提供[SCXK(京)2016-0002]。

1.2主要試劑 四氯化碳(CCl4)購自上海柏榕生物科技有限公司，橄欖油購自北京中企華業食品有限公司，兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗體、兔抗α-SMA多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司，卡托普利購自上海華源安徽仁濟制藥有限公司。

1.3方法

1.3.1動物分組、肝纖維化模型復制及給藥方法 采用皮下注射CCl4法復制肝纖維化動物模型：將40只SD大鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、卡托普利(ACEI)高、中、低劑量組，每組8只。所有大鼠可自由飲水，同時給予標準飼料喂養。除對照組外，其余各組大鼠皮下注射以橄欖油稀釋的10%CCl4(5 mL/kg)，對照組大鼠注射等體積的橄欖油，每周2次，共20周；從注射造模第5周開始，ACEI組分別每日給予卡托普利(20 mg/kg、15 mg/kg和10 mg/kg)灌胃治療，同時對照組與模型組給予等量生理鹽水直至造模結束。

1.3.2標本獲取及保存 (1)血清標本采集：造模結束后大鼠禁食不禁水8 h，稱重，麻醉后開腹，于腹主動脈取血8～10 mL，靜置2 h后離心(4 000rpm，4℃)15 min后取上清液，分裝后于-80 ℃冰箱凍存。(2)肝組織標本收集：完整切離肝臟，分別于各肝葉處取1塊肝臟(厚約4mm)，于4 %多聚甲醛固定液中固定至少24 h、常規脫水、石蠟包埋，將剩余肝臟組織切塊，分裝于凍存管中，于-80 ℃冰箱凍存。(3)肝組織RNA提取：采用Trizol法提取RNA，反轉錄為cDNA，于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.3RT-PCR 使用TRIzol法提取肝組織總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計測定RNA的質量和濃度，A260/A280為1.18～2.10。使用RT-PCR兩步法試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA后進行擴增反應。將PCR反應產物分別在2 %瓊脂糖凝膠上電泳，用Tanon1600凝膠成像系統對DNA條帶進行吸光度掃描，與相應GAPDH吸光度的比值為Collagen Ⅰ和α-SMA的相對表達水平。實驗重復3次以上，取均值。PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4免疫組化分析 取肝組織石蠟切片，采用SP法免疫組織化學染色檢測Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達，DAB顯色后，鏡下觀察，視野中呈棕黃色的細胞為陽性細胞。每張切片隨機選取5個視野拍照，應用圖像分析軟件Image-Pro-Plus6.0測定目的蛋白的平均光密度值[積分光密度(IOD SUM)/組織面積(Area SUM)]，檢測目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1各組大鼠肝功能比較

2.1.1血清谷丙轉氨酶水平比較 對照組、模型組與ACEI各治療組5組間比較，差異有統計學意義(F=20.014，P=0.000)；進一步進行兩組間比較，與對照組比較，模型組血清ALT表達水平升高(P=0.000)，與模型組比較，ACEI高、中、低劑量組血清ALT表達水平降低(P均為0.000)。

2.1.2血清谷草轉氨酶水平比較 對照組、模型組與ACEI治療組5組間比較，差異有統計學意義(F=47.825，P=0.000)；進一步進行兩組間比較，與對照組比較，模型組血清AST表達水平升高(P=0.000)，與模型組比較，ACEI治療高劑量組血清AST表達降低(P=0.000),見圖1。

圖1 各組大鼠肝功能比較

2.2各組大鼠肝組織Collagen I表達水平比較

2.2.1大鼠肝組織Collagen I mRNA的表達情況 RT-PCR結果顯示，對照組、模型組與ACEI各治療組5組間比較，差異有統計學意義(F=16.687，P=0.000)；與對照組比較，模型組大鼠肝組織Collagen I mRNA 表達水平升高(P=0.000)，與模型組比較，ACEI高、中、低劑量組 Collagen I mRNA水平均降低(P均為0.000),見圖2。

2.2.2大鼠肝組織Collagen I蛋白的表達情況 免疫組化切片結果中，棕黃色染色顆粒為陽性，主要著色部位在細胞間隙。在對照組大鼠肝組織中，僅在中央靜脈及匯管區周圍可見極少量Collagen I沉積，而模型組肝組織有Collagen I大量表達，尤其在中央靜脈及匯管區周圍、纖維間隔周圍，在ACEI治療組，Collagen I的表達集中在中央靜脈及匯管區周圍。對照組、模型組與ACEI治療組5組間比較，差異有統計學意義(F=491.464，P=0.000)；進一步進行兩組間比較，與對照組相比，模型組Collagen-Ⅰ表達量增加(P=0.000)，與模型組相比，ACEI各治療組Collagen Ⅰ表達量均減少(P均為0.000),見圖3。

圖2 大鼠肝組織 Collagen I mRNA水平比較

圖3 大鼠肝組織 Collagen Ⅰ蛋白水平比較(×200)

2.3各組大鼠肝組織α-SMA表達水平比較

2.3.1大鼠肝組織α-SMA mRNA的表達情況 RT-PCR結果顯示，對照組、模型組與ACEI各治療組5組間α-SMA mRNA表達比較，差異有統計學意義(F=142.234，P=0.000)；與對照組比較，模型組大鼠肝組織α-SMA mRNA表達水平升高(P=0.000)；與模型組比較，ACEI高、中、低劑量組α-SMA mRNA水平均降低(P均為0.000),見圖4。

圖4 大鼠肝組織α-SMA mRNA水平比較

2.3.2大鼠肝組織α-SMA蛋白的表達情況 免疫組化切片中，棕黃色染色顆粒為陽性，主要著色部位在細胞間隙。在對照組大鼠肝組織中，僅在中央靜脈壁和匯管區動、靜脈壁有少量表達，與對照組相比，模型組α-SMA大量表達，尤其在纖維增生的匯管區，中央靜脈及匯管區周圍、纖維間隔周圍，在ACEI治療組中，α-SMA的表達集中在中央靜脈及匯管區周圍，纖維間隔伴有少量增生。對照組、模型組與ACEI治療組五組間比較，差異有統計學意義(F=107.382，P=0.000)；進一步進行兩組間比較，與對照組比較，模型組α-SMA的表達量增多(P=0.000)，與模型組相比，ACEI高、中、低劑量組α-SMA表達量減少(P均為0.000),見圖5。

圖5 大鼠肝組織α-SMA蛋白水平比較

3 討論

越來越多的證據表明，腎素-血管緊張素系統(Renin angiotensin system，RAS)與HSC活化、肝纖維化的發生發展密切相關。Ang Ⅱ作為RAS的效應分子，可以誘導炎癥反應和激活HSC，促進肝纖維化的發生、發展[4]。然而，拮抗RAS的作用，是否對肝纖維化有治療作用，仍需進一步研究。因此，本實驗采用RAS拮抗劑(ACEI類藥物)卡托普利進行治療，旨在探討RAS與肝纖維化的相關性，為臨床上肝纖維化的治療提供新的思路。

ALT主要分布于肝細胞胞漿，AST主要分布于肝細胞線粒體，少數分布于胞漿。由于肝細胞和血液中轉氨酶水平相差較大，肝細胞內轉氨酶的表達水平約為血液中的100倍，因此，臨床上通常用這兩種指標來反應肝細胞的損傷程度[5]。本研究結果中，模型組大鼠血清AST和ALT的表達量均升高，提示肝纖維化大鼠肝功能受損，而卡托普利治療后有下調AST和ALT的作用，結果表明卡托普利對肝纖維化大鼠肝功能具有保護作用。

研究表明，在除去肝損傷因素后，肝纖維化是可以逆轉的[6]。然而，反復肝損傷會導致肝細胞再生失敗，并且肝細胞會被異源細胞(如膠原)替代。在慢性肝纖維化中，Collagen I含量明顯增多，從而導致肝組織發生結構、功能紊亂[7]。因此，Collagen I的增生也可以作為判斷肝纖維化發生的指標之一。本結果中，模型組大鼠肝組織Collagen I mRNA和蛋白表達量均增多，說明本實驗肝纖維化動物模型復制成功，而應用卡托普利治療后，Collagen I的mRNA和蛋白表達量減少，說明卡托普利在一定程度上能夠緩解肝纖維化程度。

α-SMA通常表達于血管平滑肌細胞中，具有收縮性，有助于血管運動和收縮。在正常肝臟中，HSC呈靜止狀態，而肝損傷后，HSC受到多種因素刺激的作用而表現為活化狀態，合成并分泌α-SMA等細胞因子增多。因此，α-SMA可作為HSC激活的標志分子，在一定程度上反映HSC的激活程度[8]。本研究發現，模型組大鼠肝組織α-SMA mRNA和蛋白水平均有升高，而ACEI治療后α-SMA mRNA和蛋白水平有所降低，提示模型組大鼠體內有HSC的激活，而卡托普利治療能夠下調HSC的激活程度。因此，卡托普利緩解肝纖維化的機制與其抑制HSC的激活、干預α-SMA的表達有關。

綜上所述，本研究結果提示，ACEI類藥物卡托普利作為RAS的拮抗劑，可以保護肝纖維化大鼠的肝功能，緩解其肝纖維化程度，該作用與其抑制HSC的激活并下調肝組織Collagen I和α-SMA的表達水平有關。