顱縫早閉的分子機制及硬腦膜作用的研究進展*

張司璽，曹志威，申 杰，張春陽

[1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經外科；3.包頭醫學院神經外科疾病研究所(轉化醫學)；4.內蒙古自治區骨組織再生與損傷修復工程技術中心]

嬰幼兒時期，顱骨成擴張性生長的狀態以容納成長中的腦，這種生長主要發生在來源于未分化的間充質細胞形成顱骨之間的窄縫，稱為顱縫[2]。在新生兒中，顱縫的存在使嬰兒的頭骨更容易通過產道，并在出生后允許顱骨在大腦發育過程中進行代償性生長。當一個或多個顱縫過早閉合時，顱骨形狀的繼發性變形是由于缺乏垂直于閉合顱縫的生長，以及未閉合顱縫的補償性過度生長所致[3]。研究表明[4]，顱縫早閉的患病率逐年上升，但無明顯原因。環境因素(如宮內胎頭受限、胎位異常、羊水過少、產前暴露于致畸物質、母親吸煙、丙戊酸和苯妥英等抗癲癇藥物)和基因(單基因突變、染色體異常和多基因突變)都可能是該病的易感因素。遺傳因素約占所有顱縫早閉的20 %，大多數與顱縫早閉相關的基因以常染色體顯性方式存在。

根據閉合顱縫的不同將顱縫早閉分為矢狀縫早閉(60 %)、冠狀縫早閉(23 %)、額縫早閉(15 %)、人字縫早閉(2 %)以及多條顱縫閉合的復雜性顱縫早閉[5]。此外，根據臨床表現顱縫早閉可以分為綜合征性的，例如Apert、Crouzon或Saethre-Chotzen綜合征，以及更常見的非綜合征性的顱縫早閉，例如舟狀頭畸形(矢狀縫早閉)、前部斜頭畸形(冠狀縫早閉)、后部斜頭畸形(單側人字縫早閉)、三角頭畸形(額縫早閉)、短頭畸形(雙側冠狀縫早閉)。而綜合征性顱縫早閉除顱骨畸形以外，還有軀體其它部位的畸形如Apert綜合征的并指畸形，Crouzon和Saethre-Chotzen綜合征的特殊面部畸形，甚至還會引起患兒的認知功能發育障礙[2-3]。這些癥狀不僅威脅到患兒腦的正常發育，還對其身心健康發展造成長遠影響。因此通過研究顱縫早閉分子機制為臨床治療手段提供新的思路，提高治愈率顯得尤為重要。

1 分子機制

顱縫早閉已被證明是由多種基因突變引起，包括：MSX2，FGFR1、2、3，TWIST1，TGFBR1、TGFBR2，ERF，纖維蛋白-1(FBN1)，EFNB1，EPHRINA4(EFNA4)，RAB23，Notch配體，JAGGED1，RECQL4，MASP1，SH3PXD2B，FREM1，ALX4，和SKI。其中最常見的突變基因是FGFR2，Twist1和EFNB1[6]。

1.1Twist1基因 Twist1主要表達于胚胎中胚層，在誘導細胞移動和組織塑形中起重要作用。人類Twist1的雜合突變導致綜合征型顱縫早閉—Saethre-Chotzen綜合征[7]。有研究表明冠狀縫位于神經嵴來源的額骨和中胚層來源的頂骨之間，顱縫本身起源于中胚層，而Twist1突變小鼠胚胎顱縫堿性磷酸酶染色顯示，額骨和頂骨的成骨細胞與冠狀縫的非成骨細胞之間邊界的完整性喪失[6]。與此同時，在冠狀縫外的一層細胞中，ephrinA2、ephrinA4和EphA4的表達減少。Ephrins是與Eph受體相互作用的膜結合配體，Eph受體是一大類受體酪氨酸激酶。Ephrin-Eph信號調節多種發育過程，包括發育邊界的建立。因此在細胞中Twist1的控制下，ePhin信號作用于維持冠狀縫處的成骨-非成骨邊界，失去這一邊界的完整性會導致成骨細胞進入顱縫，導致顱縫具有成骨特性，并最終導致顱縫的骨化。

1.2EFNB1基因 Ephin-B1由EFNB1基因編碼，屬于Eph受體(受體酪氨酸激酶)配體的B亞類。Eph/ephrin信號對胚胎的發育過程起到重要作用，包括骨骼和面顱的發育。X染色體連鎖的EFNB1基因雜合突變會導致一種特定的綜合征顱縫早閉-Craniofrontonasal syndrome(CFNS)[8]。有實驗通過檢測小鼠Efnb1在胚胎期(E)9.5 d和10.5 d(額頂邊界建立的時間)的RNA表達，發現最頂端的Efnb1表達區域與神經嵴起源的、未來的額骨區域和潛在的端腦小泡神經上皮相對應，但在形成頂骨的間充質中缺失[9]。小鼠Efnb1在神經嵴表達，但不在頭部中胚層表達。因此，在這些組織交界處形成的冠狀縫位于Efnb1表達的邊界。研究表明Eph受體和ephrins的表達是相互的，通過界面上的排斥性相互作用，組織細胞的定位和/或移動，包括限制遷移神經嵴細胞(NCC)到胚胎的特定區域[10]。而通過對基因敲除(KO)Efnb1小鼠的分析發現不表達ePhin-B1的細胞出現同型細胞分類，形成異位組織邊界。綜上所述，EFNB1通過對特定細胞的分選對建立和維持顱縫邊界發揮作用，若該基因缺失會出現組織細胞混亂從而形成異常邊界導致顱縫早閉。

2 硬腦膜與顱縫早閉

大量實驗研究和臨床證據表明，硬腦膜影響上覆縫線復合體的生物學功能[11]。在動物模型中觀察到硬腦膜的骨誘導特性，其中顱蓋骨移植物的礦化和額后縫閉合取決于與完整硬腦膜的接觸。在臨床領域，顱縫早閉的患者僅拆除縫線往往會導致縫線的再骨化。目前，手術包括切除受影響的縫線和復雜的顱骨重塑過程，仍然是標準的治療方法[12]。然而，這些手術對嬰兒患者來說是生理上的嚴峻挑戰，而且切除的縫線極易復發。未來顱縫早閉微創療法的發展有賴于對顱縫生物學調控機制的透徹理解。因此了解硬腦膜對顱縫發育的影響機制對解決顱縫早閉這一難題尤為重要。

硬腦膜是硬腦膜成纖維細胞產生的富含膠原骨架的纖維組織。胎兒和新生動物的未成熟硬腦膜似乎也含有成骨細胞亞群，這些細胞亞群可以分化為成骨細胞，也可以通過旁分泌信號促進顱骨成骨細胞分化。許多研究表明硬腦膜通過轉錄因子、激素和生長因子調節成骨細胞的增殖和分化來引導顱骨和顱縫的發育。其他研究也證明未成熟的硬腦膜細胞具有分化為成骨細胞的能力，從而產生骨基質蛋白[13]。

2.1FGFR2基因 成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)是一種表達于縫隙間充質﹑成骨前緣和硬腦膜的跨膜受體，在細胞遷移、血管生成、上皮間充質相互作用以及骨的發育和修復中發揮重要作用，已被證明在體內和體外以旁分泌或自分泌的方式促進成骨細胞的增殖和骨形成。其突變與顱縫早閉的發病機制有關。FGFR2中C278F或P253R突變分別導致Crouzon綜合征和Apert綜合征[14]。目前有實驗通過將突變型FGFR2(C278F和P253R)構建體亞克隆入腺病毒載體中，獲得重組腺病毒FGFR2，并將這些腺病毒轉染到硬腦膜細胞和成骨細胞中[15]。發現直接轉染Crouzon(C278F-FGFR2)突變的成骨細胞顯示細胞增殖增加。直接轉染Apert(P253R-FGFR2)突變的成骨細胞顯示堿性磷酸酶活性增加。在共培養實驗中，與Crouzon轉染的硬腦膜細胞共培養的成骨細胞表現出明顯的細胞增殖，而與Apert轉染的硬腦膜細胞共同培養的成骨細胞表現出明顯的堿性磷酸酶活性。此外，成骨基因(堿性磷酸酶、骨橋蛋白和Runx2)的表達在成骨細胞與表達Apert的硬膜細胞共培養中上調。Crouzon(C278F-FGFR2)突變可以促進細胞增殖，提示硬腦膜可能通過增加縫隙間充質中的成骨細胞數量來促進Crouzon綜合征的縫線融合。而硬腦膜細胞中的Apert(P253R-FGFR2)突變增加了共培養中成骨細胞的成骨分化。綜上所述，硬腦膜細胞中的P253R-FGFR2和C278F-FGFR2突變都改變了正常的硬腦膜信號。這提示FGFR2突變可能部分通過結構性突變誘導硬腦膜FGFR信號轉導，增強硬腦膜介導的成骨作用，從而誘導顱縫早閉。

2.2不同硬腦膜區域作用的差異性 顱縫包括額縫、矢狀縫、冠狀縫、人字縫和鱗狀縫。出生后額縫首先閉合，其次是人字縫，矢狀縫最晚閉合。因此猜測不同硬腦膜區域在促進顱縫發育時具有時間和空間上的差異性。有實驗通過在SD大鼠身上進行自體移植手術，將額后縫和冠狀縫重新定位在非縫線、額后縫或冠狀縫相關的硬腦膜區域上：(1)原位(對照組)，(2)旋轉45°，(3)旋轉90°。手術在大鼠出生后第8 d，即大鼠額后縫閉合之前進行[11]。術后1個月檢查不同的硬腦膜區域對額后縫和冠狀縫通暢率、閉合率的影響。結果發現對照組所有標本都顯示正常縫線形態，額后縫閉合，冠狀縫保持通暢。額后縫的閉合遵循正常順序，從前到后，從顱內到外顱的方向進行。45°組覆蓋在非縫線硬腦膜上的額后縫顯示完全融合，但均薄于對照組，且獨特的顱骨內脊也明顯變鈍。旋轉的冠狀縫仍然開放。90°旋轉組覆蓋在冠狀縫相關硬腦膜上的額后縫均閉合，但其形態明顯比對照組薄。旋轉的左冠狀縫線覆蓋在與額后縫相關的硬腦膜上，均被發現是開放的，然而這些冠狀縫采用了額后縫的形態。同時有證據證明與移植的成人硬腦膜相比，移植的未成熟硬腦膜可以誘導顱骨缺損的骨再生。縫線下局部硬腦膜的操作被證明可以誘導或阻止顱縫融合[16]。這些研究表明，來自硬腦膜不同區域的細胞行為不同，其中一個區域可能促進成骨和顱縫融合，而另一個區域則維持顱縫通暢。此外，硬腦膜的同一區域可能會隨著時間的推移而改變，在發育早期保持縫線通暢，并在面顱骨成熟時允許縫線閉合。因此，硬腦膜細胞可能包含具有促成骨能力的細胞和被編程為抑制成骨和顱縫閉合的細胞。

3 總結

顱縫早閉，尤其是綜合征型，通常與認知發育受損的較高風險有關。這是由于大腦生長受限，以及過度生長的縫線和增加的顱內壓導致腦組織繼發變形所致。因此了解該疾病的患病機制對提高患兒治愈率及降低致畸致殘率具有重要意義。顱縫早閉的致病原因中，基因突變大約占20 %。例如：(1)FGFR2突變增強顱縫間充質細胞的成骨活性，從而使顱縫過早閉合；(2)Twist1和EFNB1突變破壞顱縫與周圍組織的成骨-非成骨邊界的完整性或形成異常的成骨-非成骨邊界，導致成骨細胞進入顱縫內并激活其內間充質細胞的成骨活性，最終導致顱縫骨化。此外硬腦膜通過分泌一些可溶性因子來控制顱縫的生長發育。目前治療手段多是手術切除早閉的顱縫并人造縫線，但其中一部分患者會復發，給患者和家庭帶來嚴重的痛苦和負擔。因此可以考慮在手術中補充一些外源性因子或利用細胞工程，在縫線處調控顱縫的閉合進程，進而防止顱骨畸形的產生。

顱縫早閉綜合征的特征相互重疊，即使在同一綜合征中也存在表型異質性，尤其是在Muenke綜合征的情況下，臨床評估不足會導致誤診，而分子檢測有助診斷。在有FGFR2、Twist1和EFNB1基因突變的兒童中，67 %的兒童需要重復面顱外科手術，而在染色體異常或沒有基因診斷的患者中，只有6.25 %的患者接受或計劃再次手術。僅靠臨床表現來診斷顱縫早閉往往會出現誤診，例如最初診斷為Pfeiffer綜合征的患者，通過基因診斷實為Twist1基因突變導致的Saethre-Chotzen綜合征；最初診斷為Apert綜合征的患者，通過基因檢測后糾正為EFNB1基因突變導致的CFNS綜合征[17]。因此通過分子檢測建立完善的基因型-表型相關性分析，對不同類型顱縫早閉的鑒別診斷具有重要意義,達到早診斷早治療的目的。

鑒于顱縫早閉是一種由多因素相互作用導致的復雜性疾病，其診斷﹑評估﹑治療及康復是一漫長而艱難的過程。因此對顱縫早閉患者的臨床評估和描述應由包括分子遺傳學家在內的專門醫療團隊進行，徹底的臨床評估可以指導分子檢測，從而全方位的提高患者的生存質量。