STING-Caspase-1信號通路對創傷性顱腦損傷大鼠認知功能障礙的作用

齊曼曼?王旭鵬?李妍?孫文波

【摘要】目的 探討干擾素基因刺激蛋白（STING）-半胱天冬酶（Caspase-1）信號通路在顱腦創傷致大鼠認知功能障礙中的作用。方法 將48只清潔級雄性SD大鼠隨機分為4組，假手術組（S組）、模型組（M組）、STING抑制劑C-176組（C組）和STING激動劑ADU-s100組（A組）各12只。通過重物自由落體撞擊硬腦膜法建立創傷性顱腦損傷（TBI）模型。M組、C組和A組大鼠建立TBI模型后，C組和A組分別經腹腔注射C-176 10 mg/kg和ADU-s100 10 mg/kg。S組只行骨瓣開窗術。建模后第7日行Morris水迷宮測試評估大鼠認知功能，然后處死大鼠取其海馬組織，采用免疫熒光法測定STING/膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、活化Caspase-1/Neuron表達情況。結果 與S組比較，M組、C組和A組大鼠Morris水迷宮測試的潛伏期延長，穿越平臺次數減少，目標象限停留時間縮短，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調（P均< 0.05）。與C組比較，M組、A組大鼠潛伏期延長，穿越平臺次數減少，目標象限停留時間縮短，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調（P均< 0.05）。與A組比較，M組大鼠潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，目標象限停留時間延長，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率G下調（P均< 0.05）。結論 STING-Caspase-1信號通路可能參與了TBI中認知功能障礙的病理生理過程。

【關鍵詞】干擾素基因刺激蛋白;創傷性顱腦損傷;認知功能;細胞焦亡;大鼠;

Morris水迷宮測試

Effect of STING-Caspase-1 signaling pathway on cognitive impairment induced by traumatic brain injury in rat models Qi Manman， Wang Xupeng， Li Yan， Sun Wenbo. Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Cangzhou 061000， China

Corresponding author， Sun Wenbo， E-mail： 15103172838@ 139. com

【Abstract】Objective To explore the role of stimulator of interferon genes （STING）-Caspase-1 signaling pathway on cognitive impairment induced by traumatic brain injury （TBI） in rat models. Methods Forty-eight clean grade healthy male SD rats were randomly and evenly divided into the sham-operation group （S group）， model group （M group）， C-176 group （C group） and ADU-s100 group （A group）. TBI rat models were established by using a weight-drop head injury method. After the establishment of TBI rat models， C-176 （10 mg/kg） and ADU-s100 （10 mg/kg） were injected intraperitoneally in the C and A groups. Bone flap fenestration alone was performed in the S group. At 7 d after the model was established， Morris water maze was performed to assess the cognitive ability of rats. Then， the rats were sacrificed and the hippocampus was taken. Immunofluorescent staining was used to determine the expression levels of STING/glial fibrillary acidic protein （GFAP） and cleaved-Caspase-1/Neuron. Results Compared with the S group， the latency was significantly prolonged， the number of passing the platform was remarkably reduced， the time of stay in the target quadrant was considerably shortened， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly up-regulated in the M， C and A groups （all P < 0.05）. Compared with the C group， the latency was significantly prolonged， the number of passing the platform was remarkably reduced， the time of stay in the target quadrant was considerably shortened， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly up-regulated in the M and A groups （all P < 0.05）. Compared with the A group， the latency was significantly shortened， the number of passing the platform was remarkably increased， the time of stay in the target quadrant was considerably prolonged， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly down-regulated in the M group （all P < 0.05）. Conclusion STING-Caspase-1 signaling pathway is probably involved with the pathophysiological process of cognitive impairment induced by TBI in rat models.

【Key words】Stimulator of interferon genes;Traumatic brain injury;Cognitive function;Pyroptosis;

Rat;Morris water maze

創傷性顱腦損傷（TBI）是一種常見的、預后不良的意外傷害，近幾年發生率不斷攀高[1-2]。認知功能障礙是TBI后常見并發癥，嚴重影響患者生活質量[3-4]。TBI的病理生理過程非常復雜，半胱天冬酶-1（Caspase-1）介導的炎性反應是細胞焦亡的經典途徑，也是TBI發生發展的重要機制之一[5-6]。

Abdullah等[7]的研究表明，干擾素基因刺激蛋白（STING）信號通路的激活參與了TBI模型的腦損傷過程，并引起神經細胞焦亡。STING信號通路作為胞內感受器，其下游產物參與了多種炎癥反應。但STING信號通路是否通過介導細胞焦亡進而調控TBI后海馬組織的炎性反應尚未清楚。本課題組擬探討STING-Caspase-1信號通路對TBI大鼠認知功能的作用。

材料與方法

一、動物選擇及分組

清潔級健康雄性SD大鼠48只，9 ～ 10周齡，350 ～ 400 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[許可證號：SYXK（京）2012-0036]。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（S組）、模型組（M組）、STING抑制劑C-176組（C組）和STING激動劑ADU-s100組（A組）各12只。對M組、C組和A組大鼠建立TBI模型。參考文獻[8-9]，C組和A組建模后分別于腹腔注射C-176 10 mg/kg（上海皓元生物醫藥科技有限公司）和ADU-s100 10 mg/kg（上海皓元生物醫藥科技有限公司）。S組只行骨瓣開窗術。本研究符合動物實驗倫理規范，通過滄州市中心醫院倫理委員會審批[2020-006-01（Z）]。

二、TBI模型建立

于6% ～ 8%濃度的七氟烷下對大鼠進行麻醉誘導，采用面罩下自主呼吸吸入七氟烷（3% ～ 4%）和空氣（1 L/min）的方式進行麻醉維持。將大鼠俯臥固定于鋪有溫毯的操作臺上，設定溫毯加熱溫度為38℃，對其進行體溫監測及心電監測（上海玉研科學儀器有限公司，型號：XMTF-7000）。對大鼠作以下處理，頭部皮膚消毒，鋪巾，取正中切口并暴露頂骨，在前囟點后3.0 mm，中線右側1.5 mm處開直徑為6 mm的骨窗并保持硬膜完整。隨后固定于立體定位儀（上海玉研科學儀器有限公司）上，將墊片（r = 2.5 mm）置于硬膜上，取20 g砝碼于25 cm高度自由落體式撞擊墊片上方撞桿，撞擊處腫脹而硬膜不破裂為TBI模型成功。用骨蠟封閉骨瓣，雙極電刀（武漢春光醫療美容儀器有限公司，型號：CHR-V）止血，縫合皮膚。

三、檢測指標

1.采用Morris水迷宮測試評估空間記憶能力

進行Morris水迷宮測試前6 d為訓練期。把實驗平臺置于水下1 cm，將大鼠面朝池壁隨機放于水中任一象限內，當大鼠找到平臺后，允許其在平臺上休息30 s，并記錄大鼠搜索平臺所用時間，即潛伏期。如果在90 s內找不到平臺，將其放置在平臺上休息30 s，記錄搜索平臺的時間為90 s。確保所有象限在1 d內使用1次。第7 日為記憶期。第8日進行測試，移除平臺，將大鼠面朝池壁隨機放于水中任一象限。采用動物行為視頻分析系統（上海吉量軟件科技有限公司）跟蹤記錄大鼠的潛伏期、運動軌跡和穿越平臺次數，并分析其空間記憶能力。

2.采用免疫熒光法測定STING/膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、活化Caspase-1/Neuron表達

結束Morris水迷宮測試后于七氟烷深麻醉下處死大鼠，經主動脈灌注40 g/L多聚甲醛后，取其腦組織并在10% 多聚甲醛中固定48 h，隨后進行石蠟切片。將切片放入10 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復液中煮沸10 min，于常溫下用0.3% Trion孵育20 min，加入免疫封閉液于37℃溫箱內孵育1 h，

分別滴加兔多克隆抗體STING（稀釋度1∶500，Abcam公司）和小鼠單克隆抗體GFAP（稀釋度1∶500，上海碧云天生物技術有限公司），兔單克隆抗體活化Caspase-1（稀釋度1∶500，Abcam公司）和小鼠單克隆抗體Neuron（稀釋度1∶500，Abcam公司）一抗，于4 ℃孵育箱中過夜，然后分別加入Cy3標記山羊抗兔IgG（稀釋度1∶200，上海碧云天生物技術有限公司）和FITC標記山羊抗小鼠（稀釋度1∶200，上海碧云天生物技術有限公司）37℃孵育1 h。滴加DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）后封片，于熒光顯微鏡（廣州明美電子有限公司）下觀察并計數，計算STING-Cy3/GFAP-FITC/DAPI、活化Caspase-1-Cy3/Neuron-FITC/DAPI三陽性細胞數占總細胞的百分比，計數5個高倍視野取平均值。

四、統計學處理

采用SPSS 21.0處理數據，正態分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、Morris水迷宮測試結果

Morris水迷宮測試結果顯示，與S組比較，M組、C組和A組大鼠潛伏期延長，穿越平臺次數減少，目標象限停留時間縮短;與C組比較，M組、A組大鼠潛伏期延長，穿越平臺次數減少，目標象限停留時間縮短;與A組比較，M組大鼠潛伏期縮短，穿越平臺次數增多，目標象限停留時間延長（P均< 0.05）;4組大鼠游泳速度差異無統計學意義（P > 0.05），見表1、圖1。

二、海馬組織STING和活化Caspase-1表達的比較

與S組比較，M組、C組和A組大鼠的海馬組織STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調;與C組比較，M組、A組大鼠的海馬組織STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調;與A組比較，M組大鼠的海馬組織STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率下調（P均< 0.05），見表2與圖2、3。

討論

嚴重的創傷應激以及神經細胞的損傷可致TBI患者出現嚴重的認知功能障礙和明顯的精神問題[10]。本研究組通過重物自由落體撞擊硬腦膜法制備TBI模型，此法由于去除了顱骨，可避免因顱骨的差異性導致的損傷差異，當重物砸下時，完整的硬腦膜分散了沖擊力，形成彌漫性腦損傷而不至于使損傷太過嚴重，提高了大鼠的生存率[11]。Morris水迷宮測試作為神經行為學經典實驗，可反映大鼠的空間學習和記憶能力[12]。本研究結果表明，TBI大鼠海馬組織代謝紊亂，空間記憶能力下降，提示海馬組織受損并伴有認知功能障礙進而說明TBI模型制備成功。

星形膠質細胞是哺乳動物大腦內分布最廣泛的一類細胞，也是膠質細胞中體積最大的一種[13]。以往的觀點是星形膠質細胞只是起到支持作用，而不直接參與行為調節和學習記憶過程。近年來，科學家們開始仔細研究星形膠質細胞的各種潛在作用，發現其可調節葡萄糖代謝，維持線粒體穩定，促進學習記憶[14]。亦有研究表明，星形膠質細胞可以通過STING通路參與神經元的炎性反應進而介導各種精神疾病的病理生理過程[15]。GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，GFAP升高是中樞神經系統對損傷作出反應的標志性信號[16]。

環狀鳥苷酸腺苷合酶（cGAS）-STING信號通路即是胞質DNA（細胞死亡后，核中DNA進入胞質中）與cGAS結合后傳遞至第二信使環化二核苷酸（cGAMP），二聚體的STNG與cGAMP結合后發生構象改變，再通過一系列反應，募集TANK結合激酶1蛋白，進而磷酸化并激活干擾素調節因子和核因子活化B細胞κ輕鏈增強子，后者誘導了I型干擾素并激活了Caspase-1介導的細胞焦亡[17-18]。Caspase-1具促炎性，其催化活性受到炎性體依賴于信號的自身激活作用的嚴格調控[19]。依賴于炎性體的Caspase-1活化所致的具有高度炎性特征的細胞死亡即為細胞焦亡。細胞焦亡是一把雙刃劍，其在消滅病原體的同時，過度免疫反應也會誘發多種自身免疫[20-21]。

本研究結果表明，TBI后大鼠出現認知障礙，同時伴有SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表達上調;當加入STING激動劑后大鼠死亡率增加，認知功能障礙加重，SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表達上調顯著;當加入STING抑制劑后，大鼠認知功能改善，SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表達下調，提示星形膠質細胞可能通過STING-Caspase-1通路參與了TBI模型中認知功能障礙的病理生理過程。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-11-29）

（本文編輯：洪悅民）