羧甲基纖維素-大豆分離蛋白農藥緩釋顆粒的制備及性能

李梓泳，馬憬希，趙明，陳龍，周紅軍，周新華

（仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東省普通高校農用綠色精細化學品重點實驗室，廣東廣州510225）

農藥在使用過程中，噴霧漂移、葉面流失、蒸發、紫外線降解等都會造成農藥的利用率低下；雨水的沖刷、氣凝膠的流動等可能會使農藥通過生物鏈給人類的健康帶來不利的影響；因此提高農藥利用率、減少農藥流失已成為農藥發展的主流方向。制備控釋農藥是滿足上述條件的有效方法，而控釋農藥種類繁多，如微膠囊包裹、介孔吸附、凝膠負載等[1]。Zhang等[2]利用聚酯和聚乙二醇開發了一種溫度響應型混合膠束來控制除蟲菊酯的釋放，提高了除蟲菊酯的光穩定性，增長了活性成分的存活時間，比商業配方有更好的利用效率。Liang等[3]利用可降解淀粉修飾二硫鍵功能化介孔硅，制備了具有氧化還原響應和酶響應的納米粒子，有效防止阿維菌素的光降解，阻止其過早泄露。此外，納米粒子對小菜蛾幼蟲具有良好的殺蟲活性，實現了農藥的靶向釋放。顏慧瓊[4]利用海藻酸鈉衍生物、膨潤土和殼聚糖制備負載啶蟲脒的凝膠，在水溶液中有好的穩定性能和緩釋性能。

在提高農藥效率的同時，也應該重視控釋農藥的載體性質。天然高分子載體具有制備簡單、來源廣泛、可降解、生物相容性好等優勢。羧甲基纖維素（CMC）是一種天然的陰離子水溶性多糖，是纖維素的衍生物，具有黏著、增稠、流動、乳化性，應用于食品、醫藥、日化等行業。其中，已經有很多關于CMC在緩釋農藥應用方面的報道。Hao等[5]用疏水改性的CMC通過靜電作用包封磷酸化玉米醇溶蛋白，負載阿維菌素（AVM）后的平均粒徑為360nm，封裝效率提高了82.11%，對葉片的黏附性能也提高了約20%，在有效防止紫外光降解的同時還保持與原藥無明顯差異的毒力效果。Sarkar等[6]用CMC和檸檬酸與膨潤土制備的pH響應農藥載體，讓觸發殺蟲劑精準地在堿性內臟釋放。但親水性強的CMC單獨作為載體負載農藥時負載率低。陳龍等[7]將甲基丙烯酸甲酯接枝到CMC上制備的微膠囊提高了AVM在葉片上的親和性。大豆分離蛋白（SP）是一種豐富的原料，在釋放系統中可促進蛋白質與營養物質的相互作用[8]。Di Giorgio等[9]使用乳化法將魚油包封在SP中，包封率達88%，但該工藝需要使用大量的乳化劑，還需要昂貴的噴霧干燥機將所需產品分離。

本文以CMC和SP為原料，制備負載AVM的緩釋體系。利用紅外光譜（FTIR）、掃描電鏡（SEM）和熱重（TGA）等對CMC-SP@AVM穩定性和微觀結構進行表征，并對其包封效率、抗紫外線性能和毒理性能進行研究。此外，在不同pH和配比下，探究CMC-SP@AVM釋放AVM的機理。

1 實驗

1.1 實驗材料

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二碳亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），以上材料均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司的分析純級產品；羧甲基纖維素（CMC，300～800mPa·s），上海阿拉丁試劑公司提供；大豆分離蛋白（SP）由安陽天力食品有限公司提供的大豆脫脂蛋白粉提取[10]；阿維菌素（AVM，工業級，純度為95%），河北威遠生物化工有限公司提供；溴化鉀（分析純），廣州化學試劑廠；無水乙醇（分析純），天津大茂化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計，T6型，北京新世紀有限公司；差示掃描量熱儀，Q200型，美國賽默飛世爾科技公司；傅里葉變換紅外光譜儀，Spectrum100型，美國賽默飛世爾科技公司；熱重分析儀，TGA2型，瑞士梅特勒-托利多公司；激光粒度儀，90Puls型，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 羧甲基纖維素-大豆分離蛋白（CMC-SP）的制備

稱取3.0g SP于100mL去離子水中，然后依次滴入0.5g APTES、2.5g EDC和5g NHS，在室溫下攪拌1h。將所得溶液在水中透析24h以除去小分子，得到A-SP。添加1.5g CMC于上述所得溶液，并在80℃下加熱反應24h。冷凍干燥后得到CMCSP（mCMC∶mSP＝1∶2），并以此法制備1∶1和2∶1的CMC-SP。合成機理如圖1所示。

1.4 CMC-SP@AVM的制備

圖1 CMC-SP的合成

采用自組裝法制備了CMC-SP@AVM。首先加1.0g AVM于100mL無水乙醇中制備10mg/mL的AVM溶液，然后將0.1g CMC-SP粉末溶解在90mL去離子水中，加2mL AVM溶液，并定容至100mL，最后經磁力攪拌30min，得到穩定分散的CMCSP@AVM懸浮液。

1.5 結構表征及性能測試

1.5.1 傅里葉紅外光譜（FTIR）

利用溴化鉀壓片法表征和比較CMC、SP、CMC-SP，掃描波長為4000～450cm-1，分辨率為2cm-1。

1.5.2 熱重（TGA）

氮氣氛圍下（20mL/min），升溫速率為10℃/min，升溫范圍為30～800℃，分析SP、CMC、CMC-SP的熱穩定性。

1.5.3 掃描電鏡（SEM）

將一小滴樣品溶液置于干凈的表面，在室溫下蒸發溶劑，然后噴金，在加速電壓為15kV下獲得樣品的SEM形貌圖。

1.5.4 載藥性能測試

取4mL新鮮制備的CMC-SP@AVM懸浮液置于離心管，10000r/min離心10min。取1mL上清液于棕色容量瓶中，并用無水乙醇定容至25mL。用紫外分光光度計在245nm下測吸光度，根據式(1)計算阿維菌素的包封率（EE，%）。

式中，mtotalAVM為體系AVM總質量，g；mfreeAVM為體系中未包封的阿維菌素質量，g。

1.5.5 抗紫外性能實驗

10mL新鮮制備的CMC-SP@AVM懸浮液分散于90mL水溶液中，在距離20cm的紫外光源（16W）的照射下，進行抗紫外性能實驗。然后每隔一段時間取出一部分溶液，并用紫外分光光度計測量吸光度。由式(2)可計算得殘留率（Rv，%）。

式中，A0為AVM在溶液中的初始濃度，mg/mL；Ai為不同光照時間后樣品中的AVM濃度，mg/mL。

1.5.6 AVM緩釋實驗

將新鮮制備的CMC-SP@AVM懸浮液（5mL）放入到透析袋中，并置于錐形瓶中，然后在室溫下加入50%的乙醇水溶液（50mL）進行透析，往乙醇溶液中加入HCl或NaOH來控制緩釋溶液的pH。在一定的時間間隔下，取1mL樣品于紫外分光光度計測量樣品溶液的AVM濃度，并及時加入1mL相應的乙醇水溶液至錐形瓶。根據標準曲線：A=0.03782C-0.04705(R2=0.999)計算AVM濃度。累積釋放率（Ri，%）按照式(3)計算。

式中，Ci為每個樣品在不同時間間隔時AVM的濃度，mg/mL；mAVM為錐形瓶中AVM的總質量，g。

1.5.7 殺蟲活性

將白菜葉子（大小為2cm×2cm）分別浸泡在濃 度 為200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L和3.125mg/L的CMC-SP@AVM溶液里，待其自然干燥后，與10條2齡的小菜蛾一同放入墊有濾紙的培養皿中，于恒溫室中培養48h后觀察其死亡率，刺激時不能移動則視為死亡。用AVM乙醇溶液處理昆蟲作為對照組，并計算死亡率和校正死亡率。

2 結果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

圖2 CMC、SP和CMC-SP的紅外光譜圖

如圖2所示，CMC曲線中，3500cm-1處出現的寬吸收峰是羥基、分子間和分子內氫鍵的伸縮振動峰[11]。2920cm-1左右出現—CH2—的伸縮振動峰，在1595cm-1處出現—COO不對稱伸縮振動峰，1416cm-1和1323cm-1處出現羧甲基的對稱伸縮振動峰[12]。在SP曲線中，3294cm-1左右出現的峰是由蛋白質鏈和水分之間的氫鍵引起的，1654cm-1和1542cm-1處出現酰胺鍵的吸收峰，在1241cm-1處的吸收帶是由C—N伸縮振動和N—H彎曲振動引起的，1060cm-1處出現C—H平面外的振動峰[13]。在CMC-SP曲線中，酰胺I的吸收峰出現在1645cm-1處，表明APTES的氨基與SP反應生成新的酰胺鍵，導致吸收峰發生了紅移。1710cm-1處出現的吸收峰可能是APTES水解后產生的羥基與SP上的羧基反應產生酯基[14]。另外，羧甲基對稱伸縮振動在1416cm-1和1323cm-1處的峰也在CMC-SP中出現。CMC的C—O—C振動具有強烈吸收帶，與在1150cm-1和1135cm-1處出現的Si—O—C和Si—O—Si的典型信號峰重疊[15]。

2.2 熱重分析

圖3(a)是CMC、SP和CMC-SP在40～600℃的TGA曲線。各樣品在100℃左右的質量損失是由于樣品中少量殘留水分的蒸發。CMC在260℃開始分解，并且質量損失較大，因為CMC中的羧基在這個溫度范圍分解成二氧化碳[16]，最后的質量損失率為60%。SP在204～300℃之間開始劇烈分解，質量損失峰明顯，這是由大豆分離蛋白的主鏈多肽分解引起的[17]。在400～600℃之間的分解曲線趨于平緩，這一階段主要為殘余物質的繼續緩慢分解，最終的總質量損失率為83%。CMC-SP最后的質量損失率為70%，為了進一步了解質量損失情況，對SP、CMC、CMC-SP的導數熱重（DTG）圖進行了研究。如圖3(b)所示，CMC的分解溫度質量損失峰為290℃，而SP有兩個質量損失峰分別在241℃和285℃。在此段降解過程中，分子間和分子內氫鍵、靜電作用以及疏水作用被破壞。CMC-SP的質量損失峰在248℃和313℃，因為CMC與SP反應后，分子鏈中的共價鍵數量增多，CMC-SP有更好的熱穩定性[18]，說明CMC成功接枝到SP上。

圖3 CMC、SP和CMC-SP的TGA曲線和DTG曲線

2.3 SEM分析

圖4為CMC-SP、CMC-SP@AVM和加熱后的CMC-SP@AVM的SEM圖。經Image-Pro Plus 6.0軟件測量，CMC-SP的平均尺寸為195nm，呈棱柱或棱錐狀，因為SP的三級和四級結構決定了顆粒的形狀和大小[19]。負載AVM后，粒子的棱角減少，呈現橢圓或圓形，平均粒徑減小到104nm。CMC-SP的疏水基團在疏水作用下形成一個空腔，當AVM進入該疏水腔時，形成了新的疏水平衡，重新形成的疏水腔對CMC-SP的吸引力更大，因此轉變成橢圓形[20]。負載AVM的粒子加熱后，棱角變得更少，平均粒徑增加到110nm。這是由于SP發生了蛋白質變性，暴露了疏水性基團，相鄰粒子間發生團聚[21]，增加了顆粒尺寸。

2.4 粒徑、zeta電位和載藥性能分析

如表1所示，隨著CMC-SP中SP比例的上升，其電荷值由-(15.02±0.93)mV下降到-(22.91±0.04)mV，因為SP帶負電荷。隨CMC-SP電位的下降，對AVM的靜電排斥力增強使包封率從41.9%降低到33.1%。粒子的平均粒徑變化很大，可能是由于熱變性后的蛋白質不規則聚集所致[22]。測得的平均粒徑與SEM圖差別較大，這可能是因為CMC-SP的親水性質導致CMC-SP@AVM在水中膨脹[23]。

圖4 CMC-SP、CMC-SP@AVM和加熱CMC-SP@AVM的掃描電鏡圖及其粒徑分布

表1 不同配比的CMC-SP@AVM的粒徑、電位和包封率

2.5 抗紫外分析

由圖5可知，未包封的AVM在紫外光照射下迅速降解，照射0.5h后殘留率為79.19%。連續輻射7.5h后，殘留率為43.63%。24h內殘留率僅有31.00%，且未封裝的AVM的半衰期只有3.75h。CMC-SP@AVM中AVM的殘留率比未包封的AVM高117%，這是因為CMC-SP作為物理屏障阻隔了紫外線的輻射，SP中的芳香氨基酸可以吸收紫外光并使蛋白質形成共價交聯[24]。此外，CMC中的羧基和羥基作為發色基團會吸收部分紫外光，從而減弱紫外光的強度。不同配比的CMC-SP的抗紫外效果也不同，其中mCMC∶mSP=2∶1的CMC-SP的抗紫外性能最好。因為CMC增加了CMC-SP@AVM的厚度，另外，增加的發色基團減弱了紫外光的強度[5]。

圖5 不同配比的CMC-SP@AVM的抗紫外圖

2.6 緩釋分析

圖6 不同配比下CMC-SP@AVM的緩釋曲線

圖6為CMC-SP@AVM在 不 同CMC和SP質量比下的緩釋曲線。在初始階段的14h，大量游離的AVM或在次級鍵作用下黏附于載體表面的AVM在滲透壓作用下被迅速釋放導致了緩釋初期的快速釋放，可達到75%以上[25]，說明緩釋粒子可在較短的時間內達到初期防治所需的較高濃度。而后期內外滲透壓降低，且AVM在蛋白疏水片段強吸引力的作用下，釋放速率較為緩慢。在實際應用中，CMC-SP@AVM緩釋顆粒中，大豆分離蛋白可在昆蟲腸道或環境中大量存在的蛋白酶中分解，從而促進AVM的快速釋放，起到增效的作用。

累積釋放時間到達96h后，CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=2∶1）、CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶1）和CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶2）的累積釋放率分別為68.0%，83.7%和89.2%。CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶2）的粒徑最大，AVM在釋放的過程中需跨越較長的距離，故其釋放率最小，而CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶1）與CMCSP@AVM（mCMC∶mSP=2∶1）的粒徑相差不大，但前者的電負性較大，對帶負電的AVM排斥力大，故釋放率偏大。

圖7 不同pH的CMC-SP@AVM的緩釋曲線

圖7是CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶2）在不同pH下的緩釋曲線。最終累積釋放率的變化趨勢為pH 9＞pH 7＞pH 5＞pH 3，即pH越高，釋放速率越快。當累積釋放時間為40h、pH為3時的累積釋放率為59.6%，相對緩慢。大豆分離蛋白的谷氨酸和天冬氨酸含量較高，大豆分離蛋白的等電點在4.5左右[26]。緩釋體系的pH小于等電點時，氨基質子化，CMC-SP@AVM的空間結構更加穩定，減緩了AVM的釋放速率。當pH為5時的累積釋放速率為62.38%，釋放速率相對提高。pH為7和9時的累積釋放速率在140h處都大于68%。因為當溶液的pH大于蛋白質的等電點時，羧基陰離子群之間的電荷斥力占主導地位，導致靜電相互排斥，進一步加速了AVM的釋放[23]。

據報道，具有pH響應特性的農藥緩釋劑在實際應用中可起到比商業殺蟲劑更好的效果[27]。緩釋作用有效延長了農藥的作用周期，pH響應賦予了緩釋劑在特定時間、特定環境下有效控制害蟲的特性。具體而言，根據pH響應特性，CMC-SP@AVM用于防治具有堿性中腸的植食性鱗翅目害蟲可起到較好的效果，平臺期后的緩慢釋放可以防止顆粒內的藥物被紫外光分解，并保證顆粒內存在足夠多的有效成分，在施藥后一段時間仍然能達到殺蟲效果[28]。

2.7 緩釋動力學分析

為了進一步研究其釋放機制，選取pH為3、5、7、9時的曲線進行Zero-order[29]、First-order[30]、Elovich[31]等模型擬合。模型擬合圖及擬合結果分別如表2和圖8所示。由表2可知，緩釋動力學曲線更符合回歸系數R2相對較高的Elovich模型。當pH為3、5、7、9時，Elovich模型與Gwak等[32]報道的一樣，累積釋放系統表現出a0值大、a1值小的現象，說明該粒子具有較好的緩釋性能。不同pH下的釋放動力學的差異，與材料在不同氫離子濃度下的內部結構有關。

2.8 殺蟲實驗分析

毒力分析結果如表3所示，其中AVM和CMC-SP@AVM的毒力回歸方程分別為Y=2.8998+1.1426X和Y=2.6025+1.1895X。盡管回歸方程中的常數比AVM中的小，但是其斜率大于AVM，說明在增加濃度時，CMC-SP@AVM的毒力效果逐漸接近AVM。此外，AVM的95%置信限為45.12～105.16，這意味著完全超出這個區間的概率為5%。CMCSP的包封使CMC-SP@AVM的半數致死量（103.66mg/L）高于AVM（68.88mg/L）。此外，有95%置信度說明兩種毒力效應無顯著差異。因此，CMC-SP@AVM包埋AVM可以改善AVM的各項性能，并對AVM的毒力作用無顯著影響[33]。

表2 pH模型擬合參數

圖8 不同pH下的緩釋擬合模型

表3 毒力測定計算結果

3 結論

本文合成了具有pH響應的載藥顆粒，提高了農藥的利用效率。該載藥顆粒通過對SP進行CMC的接枝改性，并利用疏水作用將AVM包裹。通過FTIR、DSC及TGA-DTG分析，表明CMC已經接枝到SP上。CMC-SP@AVM具有近似于橢圓形的結構，SEM分析顯示粒徑在104～195nm之間。接枝改性后的SP能夠持久有效地包裹AVM，包封率達41.9%。CMC-SP@AVM在乙醇溶液中溶脹釋放AVM具有pH響應性，并符合Elovich模型。抗紫外實驗表明，CMC-SP可以顯著提高AVM的抗紫外性能，有效延長AVM的半衰期。總的來說，CMCSP@AVM可以減緩農藥的光降解速率，根據環境pH特性相應釋放，有望提高農藥的有效利用率，降低農藥對環境的危害。