生物模板法制備磁性中空微球的方法和應用

黃冠華，劉序彥，房晨曦，顧慶峰，雷浩

（中國礦業大學化工學院，江蘇徐州221116）

納米中空磁性微球因具有獨特的磁響應性、比表面積大、中空結構可容納特定物質、微球殼面可進行功能化修飾等特點，在物質分離和純化、材料學和醫學等領域有較廣泛的應用，具體應用場景有功能性吸附劑[1-2]、固定化酶載體[3]、藥物的緩釋載體[4-5]、靶向藥物治療等[6-8]。

傳統制備納米磁性微球的方法主要是非生物模板法，其又分為硬模板法、軟模板法和自模板法，這3種方法各有優劣，硬模板法制備出的微球成型率高且形狀完整，但模板不易去除，易造成殘留[9-10]。軟模板法的模板易于去除，但制備出的微球破損嚴重[11]。自模板法雖然不需要模板，操作步驟較少，但需要精確控制反應時間和反應過程中pH的改變，較為困難[12]。相比之下，生物模板法以天然的生物材料為模板，用物理和化學的方法進行處理制備納米磁性中空微球，制備過程操作簡單，所用化學試劑的數量和毒性均比非生物模板要低。制得的微球形狀完整，成形率高，而且若采用軟模板法，因生物材料可通過高溫熱解炭化揮發，生物模板易于去除并且無殘留[13]。生物材料的表面還帶有豐富的活性基團，可以通過一系列反應引入特定的官能團，豐富微球的特定功能，這顯著拓寬了生物模板法制備的納米磁性微球在功能吸附、酶固定載體、物質的控釋、靶向給藥等方面的應用前景。

1 磁性中空微球的結構特點

根據磁性物質在中空微球所處的位置不同將其分為：①核磁型中空微球（karyotype magnetic hollow microspheres），磁性顆粒游離于中空微球的空腔部位，呈分散狀態［圖1(a)］；②殼磁型中空微球（shelltype magnetic hollow microspheres），磁性顆粒摻雜在其他材料表面［圖1(b)］。這兩種構型的磁性中空微球分別由不同的工藝制備而成。核磁型中空微球主要通過將磁性前體物質滲透分布到模板材料的空腔內，再通過液相高溫水熱反應生成磁性物質。而殼磁型中空微球是通過將磁性物質吸附或嵌合在模板材料的表面上形成，又或者是磁性物質的前體吸附或嵌合在模板材料的表面后經過固相高溫反應生成摻合于模板材料中的磁性物質。這兩種制備方法都可以生產具有磁性和特殊官能團的中空微球。這兩種構型的磁性中空微球都具備良好的順磁性，在外加磁場下能夠被其吸引，而在撤掉外加磁場后又能夠很好地分散。目前常用的磁性粒子主要有鐵的氧化物（Fe3O4、γ-Fe2O3）[14-15]、金屬合金（FePt、CoPt3）[16-17]、尖晶石型的磁鐵物質（Mg-Fe2O4、MnFe2O4、CoFe2O4）[18]等。其 中，Fe3O4是應用最廣泛的磁性粒子，因為其可通過水溶性鐵鹽的化學反應制備，且可以通過調節反應條件制備不同粒度的磁球。

圖1 磁性中空微球

2 生物模板法制備磁性中空微球工藝

利用生物質材料作為模板制備功能性納米中空微球具有廣泛的發展空間，其相對于傳統制備方法具有更多的優勢。首先，生物質材料具有來源廣泛、可再生性強、成本低廉等優勢。自然界存在多種多樣的微納米結構的生物材料，這些生物材料不僅形態大小均一，而且生物量巨大，可直接從外界環境中收集或者培養獲得，如具有微納米球形特征的花粉孢子、酵母微生物等陸生生物材料和微藻類水生生物材料，可通過大規模的種植和培養得到[19]，而傳統的化學材料的合成需要大量的化學試劑，會排放對環境產生巨大危害的污染物。其次，生物材料帶有豐富的活性官能團，可通過化學反應修飾，如微藻細胞、酵母細胞壁通常由纖維素、甘露聚糖、葡聚糖等構成，含有豐富的糖苷鍵和羥基官能團，可進行一系列聚合反應引入特定的官能團或通過化學反應轉換成新的活性基團[20-22]，天然形成的官能團避免了使用繁瑣的化學合成步驟。再次，生物材料熱穩定性差，可通過高溫熱解炭化揮發，無殘留[23-25]，如利用軟模板法將酵母在高溫下煅燒可以得到無酵母殘留的CeO2空心微球[25]。最后，如作為藥物緩釋載體，材料本身對身體無毒無害，生物相容性好。Diego-Taboada等[26]研究發現孢粉素微膠囊對人體內皮細胞無毒害效應。生物模板法制備磁性中空微球的設計思路分為兩類：其一，以生物材料為模板引入磁性材料后去除，如通過高溫煅燒，得到具有“空腔”結構的磁性微球，此方法為“生物軟模板法”；其二，以生物材料自身為載體負載和引入磁性物質，而生物材料結構和外形不被破壞，以水熱碳化法和高溫厭氧法制備居多，此方法為“生物自模板法”。生物模板法制備的磁性中空微球主要在吸附材料、酶固定化載體、物質的封裝與控釋等領域有較突出的應用，本文將會一一介紹。

2.1 生物軟模板法

以生物材料為模板介導制備的磁性中空微球可以在高溫炭化過程中保持和生物材料一樣完整的物理外形和尺寸，而生物基質會被炭化除去，無殘留。如Zhao等[27]將酵母細胞浸漬于混合鹽溶液中［Ce(NO3)3·6H2O，Fe(NO3)3·9H2O］，并在室溫下攪拌1h后再加入NaOH溶液，該混合體系在室溫下靜止數小時后沉淀，離心，用蒸餾水和乙醇洗滌后，沉淀物在80℃干燥6h，最后升溫至600℃高溫炭化2h，得到Fe摻雜的殼型CeO2中空微球。還可以將生物模板材料在高溫炭化下制備中空磁殼微球后，進一步通過水熱反應制備復合性磁微球。如Lu等[13]將松花粉在Fe(NO3)3溶液中浸泡一段時間，將浸泡溶脹后的松花粉在80℃下干燥2h后，在300～600℃下炭化1h，制備出γ-Fe2O3型中空磁微球。隨后，將γ-Fe2O3型中空磁微球加入到含MgSO4和尿素的混合溶液中，磁力攪拌30min后密封于高壓反應釜中，在160℃下反應10h，最后在室溫下慢慢冷卻形成的MgFe2O4/γ-Fe2O3中空微球（圖2、圖3）。一種多孔磁性微球ZnFe2O4/MgAl-LDH也可通過類似的方法制備。Sun等[28]將松花粉于Fe(NO3)3和Zn(NO3)2的乙二醇溶液中混合超聲20min，然后將混合液在室溫下靜止10h，將沉淀物過濾后600℃炭化1h得到ZnFe2O4復合物。溶解一定量的MgSO4·7H2O和Al(NO3)3·9H2O于 蒸 餾 水 中，再 加 入ZnFe2O4復 合物，混合物在140℃高壓釜中反應10h，冷卻至室溫后慢慢形成ZnFe2O4/MgAl-LDH中空微球。綜上所述，利用生物模板法制備磁性中空微球的基本工藝流程可歸納為圖4。

圖2 利用松花粉制備MgFe2O4/γ-Fe2O3多孔微球的工藝流程

圖3 SEM圖及TEM圖

圖4 生物軟模板法的磁性中空微球制備工藝

2.2 生物自模板法

由于天然生物材料，如酵母、花粉孢子、微藻等具有天然的球形外觀、具有耐酸堿的細胞壁[29]、其內容物可通過物理化學方法除去等特點，且生物材料表面具有的豐富天然活性基團，如羥基、羧基、氨基和酰胺官能團可與一些小分子化合物結合或與生物活性物質（酶、抗體、核酸等）反應，這些都有利于其自身作為模板材料使用。

2.2.1 浸漬-高溫炭化法

將微生物類材料浸漬于含鐵鹽溶液中，使其表面吸附含鐵離子，再通過惰性氣體保護下的高溫炭化形成表面具有磁性顆粒的中空炭化微球。孫予罕等[30]在水熱反應釜中加入微藻和水配置成微藻懸浮液，并依次加入鐵鹽、有機酸和催化劑，密封后通入保護性氣體置換反應釜內的空氣，然后將吸附鐵鹽的微藻置于烘箱中炭化，獲得殼磁性中空碳微球。王東升等[31]將微藻分散于4%硝酸鐵水溶液中，充分攪拌12h后離心分離藻細胞，然后使用超純水反復洗滌除去過量的硝酸鐵，將清洗后的藻細胞分散至6%NaOH溶液中加熱至105℃，冷凝回流2h。反應結束后將離心分離的藻細胞用超純水洗滌數次，最后置于石英舟中在氮氣氣氛下600℃煅燒，獲得殼磁性中空碳微球。浸漬高溫炭化法的基本工藝流程可歸納為圖5。

2.2.2 水熱碳化法

水熱碳化法是將生物材料置于密閉的水熱反應釜中，以水為反應介質，在反應溫度為200～300℃的亞臨界水中加速有機物的水解和碳化，形成具有兩親性特點的材質[31-33]。畢磊等[29]采用綠藻藻粉和3價鐵前體水溶液充分混合一段時間后，用蒸餾水充分清洗藻細胞，再將分離后的藻細胞分散后于氫氧化鈉堿性溶液中105℃處理1～2h，將充分洗滌后的材料置于水熱反應釜中200℃反應4h，最終得到內含多個Fe3O4磁性納米內核的鈴鐺結構多孔微球（RMMCMs），平均粒徑在30nm左右，球壁上存在15nm的孔道，微球內部的容積率達到80%，而且依據不同pH條件下磁性內核與BSA的可控釋放的特點，使得該微球有望應用于物質的封裝、磁分離以及磁操控下的靶向給藥領域（圖6、圖7）。Cai等[34]利用Fe(NO3)3、Co(Ac)2、尿素和NH4F的水熱反應，得到蒲公英花粉狀多孔CoFeO4微球，微球直徑為1μm左右，球表面孔尺寸為100～200nm，可負載抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素后利用交變磁場下的磁效應實現對該藥物的可控釋放。水熱碳化法的基本工藝流程可歸納為圖8。

2.2.3 常溫吸附法

常溫吸附法制備磁性微球可將磁性納米顆粒和中空微球的制備分開進行，再將高濃度磁性納米顆粒吸附于中空微球上制備高磁性的磁性中空微球。如李黎明[35]將FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O和NH3·H2O利用共沉淀法制備磁性納米Fe3O4，而后制得水基磁流體，最后利用表面吸附法使微藻與磁流體結合，使其藻細胞表面負載磁性納米顆粒。

圖5 浸漬-高溫炭化法的磁性中空微球制備工藝

圖6 RMMCMs的制備過程及TEM圖

圖7 RMMCMS的電鏡圖

圖8 水熱炭化法的磁性中空微球制備工藝

（1）吸附-共沉淀法利用微藻吸附-共沉淀法可以制備磁性生物材料，而后進一步制備成磁性中空微球。李晨等[36-37]將FeCl3、FeSO4和鹽酸混合配制成酸性鐵鹽溶液，然后加入20%的氨水，攪拌均勻得到棕色沉淀，將沉淀離心、洗滌、過濾，冷凍干燥后得到Fe3O4納米粒子。磁性納米粒子經過硫酸氫甲酯氨解預處理后，在表面生成一層無定形物質，能夠增加其對生物細胞的吸附力。將磁性納米粒子加入微藻培養液中混合振蕩2～4天，完成微藻對磁性納米粒子的吸附固定，得到磁性微藻生物吸附劑，用該磁性吸附劑對廢水中的鉛離子進行吸附，研究發現在合適的吸附條件下，最高可以除去95.7%的鉛離子和93.5%的鎘離子。通過類似的微藻吸附-共沉淀法可制備微藻基磁性石墨烯和生物炭。如路晏紅等[38]在常溫下將石墨烯超聲分散在蒸餾水中并加入含Fe3+的溶液攪拌數分鐘，然后在氮氣保護下加入含Fe2+的溶液并攪拌，之后加入氨水溶液并攪拌2h，使溶液pH≥10，得到磁性石墨烯，干燥備用。之后將磁性石墨烯、還原劑、偶聯劑分散在有機醇水溶液中并加入一定量生物炭，磁力攪拌1～2h，然后在真空下干燥備用。而后將所得混合物在500～700℃的氮氣下高溫裂解2h，洗滌后真空干燥備用。最后，將培養好的微藻與磁性石墨烯和生物炭按照一定比例混合，靜止3～8h，得到微藻基磁性石墨烯和生物炭。吸附-共沉淀法制備磁性中空微球基本工藝流程可歸納為圖9。

（2）高溫炭化-共沉淀法王玨玉[39]將生物模板高溫炭化后形成一定形貌的中空微球，再利用磁性顆粒的共沉淀方法制備磁性中空微球。如將靈芝孢子在馬弗爐中于600℃、氮氣保護下炭化4h制備中空微球，然后將其置于含Fe3+和Fe2+的鹽溶液中，滴加氨水，40℃恒溫過夜，共沉淀法制備靈芝孢子磁性中空微球。高溫炭化-共沉淀法的基本工藝流程可歸納為圖10。

微生物具有天然空腔和細胞壁結構，可以省去制備空腔的諸多步驟，相比以其他糖類物質為模板制備磁性中空微球具有顯著的優勢。主要通過軟模板法和自模板法制備微生物磁性中空微球（表1）。軟模板法以生物材料為模板，使其表面沉積和吸附可溶性磁性物質前體，再通過高溫炭化除去生物模板材料，并形成磁殼性中空微球；自模板法利用生物材料本身吸附磁性物質，或在其表面或內部吸附和負載可溶性磁性前體物質，再通過高溫炭化或水熱碳化將其轉變成磁性物質，與此同時，生物模板材料本身所帶官能團得到修飾和轉化。

圖9 吸附-共沉淀法的磁性中空微球制備工藝

圖10 高溫炭化-共沉淀法的磁性中空微球制備工藝

表1 生物模板法制備磁性中空微球工藝特點

非生物類硬模板法制備磁性中空微球以殼核結構二氧化硅磁性納米微球的研究居多，可采用兩種策略（表2）。一種是以無機材料模板吸附表面活性劑，然后在模板粒子表面生長含磁性物質殼層，最后除去模板粒子以及表面活性劑，得到殼層具有磁性、內部空心的磁性中空微球[10]。另一種是以磁性顆粒為核，并在其表面包覆SiO2形成模板，再在模板上繼續包覆功能性材料，通過除去模板形成內部磁性夾層空心的復合磁性中空微球[9-10]。以無機SiO2為硬模板的制備方法主要通過酸蝕或堿蝕破壞SiO2模板，從而達到一定中空結構的空間構象。

非生物軟模板法可通過表面活性劑形成的囊泡、膠團和高分子組織等利用分子間的弱相互作用形成具有一定空間結構特征的簇集體，但這類軟模板結構的穩定性較差，模板效率不夠高[11,41-42]。歐陽兆輝等[41]以NiFe2O4納米粒子作為磁性載體，鈦酸丁酯做鈦源，十二烷基磺酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮作模板劑，摻雜Co和Ce離子，惰性氣氛下高溫煅燒除去模板，制備得到(Co,Ce)-TiO2-SiO2/NiFe2O4磁性介孔微球。

非生物自模板法一般通過酸蝕和堿蝕無機材料制備多孔中空微球，然后通過吸附和負載磁性物質制備磁性中空微球。佟若菲等[46]將實心的二氧化硅微球用過堿性碳酸鈉進行蝕刻反應，除去實心部分得到中空微球。周田等[12]通過共沉淀法將尖晶石鐵氧體MeFe2O4包覆在中空微球表面制備SiO2/MeFe2O4中空復合微球。

表2 模板法制備磁性中空微球的技術特點

總之，以生物模板法和非生物模板法制備磁性中空微球各有優劣（表3）。非生物模板法制備中空磁性微球可選擇多種無機和有機模板材料，材料來源廣泛，操作過程繁瑣復雜；模板材料和化學試劑的大量消耗提高了微球的制造成本，也對環境造成了污染；非生物模板材料在去除的過程中條件較為苛刻，常導致微球結構的破壞或模板去除不完全。而生物模板材料正好可彌補非生物模板材料的缺點，如生物材料對環境友好，模板材料易除去且無殘留，并且由于其具備天然的中空球狀結構，可以減少工藝流程中的制備步驟[47-48]，但是生物模板材料需要進行大規模的培養和收集，材料來源受限。

3 磁性中空微球的開發和應用

功能性磁性中空微球比表面積大，中空結構可實現物質的裝載和釋放，具有優異的電化學性能和磁響應特性，便于產品的富集、分離，可在外加磁場的作用下移動到特定藥物靶點，在生物分離工程、物質的封裝與控釋、酶催化劑載體開發等領域發揮了重要作用。

3.1 吸附材料的應用

生物模板磁性微球具備較大的比表面積，具有優異的吸附能力，并且由于微球具有鐵磁性，在吸附完成后很容易實現固液分離，因此在物質的吸附、分離和作為酶催化劑的開發和應用方面具有廣泛的應用。李黎明[35]經研究發現，磁性小球藻細胞壁含有的蛋白質和多糖的功能基團能與染料分子結合，具有吸附劑的特質，可用作染料廢水的脫色劑，對剛果紅和亞甲基藍的吸附量分別可達169mg/g和216mg/g，而吸附后的磁性小球藻可通過磁鐵的吸引而快速分離（圖11）。

3.2 酶固定化載體的應用

利用生物磁性微球所攜帶的疏水區域可以吸附酶的非功能疏水區而進行酶的固定化，利用微球的磁性特征可以將所吸附的酶快速分離和回收，減少離心分離時間和能耗，利用磁性中空微球易通過磁場進行固液分離的特性可將其作為固定化載體進行酶催化劑的吸附，便于酶的分離和回收。以一種介孔SiO2/Fe3O4磁性復合微球為固定化酶載體物理吸附漆酶，吸附量可達280.7mg/g。固定化漆酶的熱穩定性和pH穩定性都明顯高于游離漆酶[45]。利用分散聚合法制備的多孔中空微球Fe3O4/P(GMADVB-St)本身帶有環氧功能基，可直接與酶分子上的氨基連接，共價固定化假絲酵母脂肪酶，固定效率達到了95.92%，具有良好的pH和溫度耐受性，固定化酶的活力回收高達73.25%，重復使用10次后活力保留約80%，具有較大的工業應用價值[49]。孢粉素微膠囊也可作為酶的固定化載體并將脂肪酶封裝于其內部，封裝的脂肪酶表現出對底物硝基苯棕櫚酸酯更高的水解效率和更強的選擇性水解萘普生的能力，而且固定化酶的重復利用率也大幅提高[50]。劉瀟[44]將Fe3O4/SiO2微球進行表面改性，使微球表面羥基被硅烷偶聯劑的氨基所取代，氨基再與甲基殼聚糖（CMCS）表面的羧基反應制備中空Fe3O4/SiO2@CMCS磁性復合微球。該微球作為果膠酶固定化載體具有很好的pH和溫度穩定性，載酶量高達231.5mg/g，在4℃下放置40天后活性是游離酶的4倍。

表3 生物模板法和非生物模板法制備磁性中空微球技術指標對比

圖11 磁性小球藻吸附剛果紅后的磁分離過程

3.3 物質的封裝與控釋

磁性中空微球因其具有多孔中空的結構和磁響應特性，具有選擇性容納和釋放某一特定尺寸物質的能力[45,49]。畢磊等[29]將一種蛋白核小球藻經過水熱碳化后制備的多磁核中空微球進行牛血清白蛋白的控釋，研究發現，當溶液中pH為5時，中空微球里的蛋白含量遠遠大于溶液中的蛋白含量，蛋白容載能力大于600mg/g；當溶液pH調至7時，蛋白逐步從微球中釋放到溶液中；繼續將溶液的pH調至9時，絕大部分的蛋白都逃逸至溶液中，此現象可解釋為在不同pH下蛋白和磁性中空微球之間的靜電相互作用的變化引起的。徐雪[9]制備得到的兩種類型的Fe2O3/TiO2磁性復合中空微球可作為藥物布洛芬的緩釋材料，載藥量分別達到33.1mg/g和92.7mg/g，并在24h內藥物的釋放率分別為70%和100%。劉瀟[44]制備的中空Fe3O4@SiO2@CMCS磁性復合微球在pH=7.4時可對藥物順鉑進行緩釋，在釋放的100h內，釋放量可達90%。Zhao等[51]制備了介孔SiO2包覆的磁性微球，并用作藥物載體，在模擬的體液環境中前24h釋放較快，70h內可以釋放87%的藥物。

利用生物軟模板法制備的磁性中空微球和傳統方法制備的磁性中空微球在結構上相比無明顯差別，但生物軟模板法制備工藝比傳統方法更為簡便，制備條件更容易控制。而利用生物自模板法具有更明顯的優勢。首先，因其具有很好的生物相容性，對人體無毒無害；其次，由于生物材料具有的親水官能團易于被化學修飾，從而可以通過改變微球的親疏水特性輕松實現對物質的封裝與控釋。如經過表面加乙酰基改性的孢粉素微膠囊可以從油水乳濁液中高效分離和富集油脂，通過簡單的碾壓又可以實現油脂的再釋放[52]。再次，可通過水熱碳化法設計合成具有特定兩親性的磁性中空微球，實現在特定的pH環境中選擇性封存和釋放藥物。Guan等[33]發現，這種兩親性中空碳微球中主要存在烷基類碳和芳香類碳兩種類型的含碳物質，烷基類碳主要來源于非碳化有機物（可離子化官能團的主要貢獻者），而芳香類碳則主要來源于碳化有機物（疏水性片段的主要貢獻者）。通過調節pH可實現可離子化官能團的質子化和去質子化過程，從而調節磁性中空微球的親疏水性。而這兩種類型的含碳物質在微球中的比例則可以通過控制水熱時間和溫度來加以調節。所以，可以通過合成特定成分的磁性中空微球來實現對不同pH的響應，使其通過磁場到達病癥部位時釋放藥物，實現磁性靶向治療的目的。

4 結語

相比于其他化學模板材料，微生物模板材料兼具硬模板材料較穩定的物理構型和軟模板材料易于碳化揮發除去的特點，是較理想的功能性微球的模板材料。特別是微生物模板材料具有天然的中空結構[47-48]且其細胞壁含有豐富的可修飾官能團，可通過化學反應接上特殊官能團或改變其親疏水性制備符合需要的兩親性中空微球[21,32]。利用微生物模板材料制備磁性微球條件較為溫和、無污染，制備的磁性中空微球具有無毒和體內不易分解的特性[53]，特別適合于在食品、醫藥等行業的應用，具有很好的生產應用前景。

雖然生物材料作為模板具有如上所述比傳統材料在某些方面更優異的性能，但作為工業化應用材料，其生產成本和使用壽命還需要進行很好的評估。首先，如作為物質吸附和酶的固定化材料，生物模板材料在多次循環使用下是否有較長壽命而具備可觀的經濟性，需通過試驗進行生產評估，但如作為靶向給藥和藥物緩釋等一次性載體，可不受重復使用條件的限制。其次，可制備特定尺寸微球的生物材料來源有限，需要大規模制備微生物細胞，這需要相關的微生物培養技術和設備支持；最后，微球的制備工藝受限于生物模板材料的尺寸和組成成分。不同的生物材料尺寸和組成成分各有不同，即使是同一種類生物材料，在不同的培養條件下，組成也有所差別，因此，利用生物材料為模板制備磁性中空微球的工藝要實時監控和改進，這需要在生產過程中進行全程監測和控制。總之，生物模板材料因具有某些其他模板材料不可替代的優勢受到越來越普遍的關注，將在特定的應用場景中發揮重要作用。