昆蟲嗅覺結合蛋白研究進展

吳 帆, 張 莉, 邱一蕾, 李紅亮

(中國計量大學生命科學學院, 浙江省生物計量及檢疫檢驗重點實驗室, 杭州 310018)

在自然界中，昆蟲是地球上種類最多、分布最廣的動物類群，與人類關系非常密切。據報道，已命名昆蟲超過100萬種，占節肢動物門80%以上，超過其他動物物種的總和(Zhang, 2013)。昆蟲之所以能夠在復雜的自然環境中脫穎而出，這與其精密復雜的嗅覺系統密不可分(Leal, 2013)。昆蟲嗅覺系統包括中樞嗅覺系統和外周嗅覺系統兩部分(Ong and Stopfer, 2012)，識別過程有4步：第1步，環境中氣味或信息素分子通過擴散進入昆蟲(觸角、足等)體表特化的感受器中；第2步，在感受器嗅覺結合蛋白的協助下，穿過血淋巴傳遞至外周神經樹突細胞膜上的嗅覺受體(Bentonetal., 2007)；第3步，信號分子與嗅覺受體發生作用，化學信號轉化為電信號并激發樹突神經興奮；第4步，樹突神經電信號經樹突嗅神經葉處理傳遞到中樞神經，做出相應的行為和生理反應(Zhou, 2010; Leal, 2013)。

作為嗅覺系統的第一個參與者，嗅覺結合蛋白發揮著重要的作用(Pelosietal., 2014a)。嗅覺結合蛋白主要包括3類：氣味結合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 proteins, NPC2) (Leal, 2013; Pelosietal., 2014a; Zhuetal., 2018)。第一個嗅覺結合蛋白于1981年在多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus觸角中鑒定，之后研究者在多種昆蟲中都有發現(Vogt and Riddiford, 1981)。本文之前，一些研究者曾對嗅覺結合蛋白作過綜述(婁永根和程家安, 2001; 王桂榮等, 2002; 萬新龍和杜永均, 2015)。但隨著各種組學及生物信息學等技術的廣泛應用，嗅覺結合蛋白的研究發展尤為迅速，又積累了豐富的知識。截至到目前，在雙翅目、鱗翅目、膜翅目、鞘翅目和半翅目等昆蟲中發現和鑒定到的嗅覺結合蛋白已經超過600個[根據Zhou(2010), Leal(2013)和 Pelosi等(2018a)等數據修正]，很多蛋白的生化功能和應用也得到了深入研究(Zhou, 2010; Britoetal., 2016; Pelosietal., 2018a; 張玉等, 2019)。本文對近年來嗅覺結合蛋白的分子特性、結構、功能和應用等方面取得的最新研究進展進行了總結和綜述。

1 嗅覺結合蛋白的分子特性、結構和作用機制

嗅覺結合蛋白是一類低分子量可溶性的親水蛋白，大小在15 kD左右，一般呈酸性。蛋白N端含有十幾個氨基酸的信號肽，用于分泌到胞外發揮功能。高級結構為球狀，可以和不同的配基分子結合。

1.1 氣味結合蛋白

OBPs家族是最早發現的嗅覺結合蛋白，數量多而且最為復雜。它們最為顯著的特征是豐富的α-螺旋和保守的半胱氨酸(Cys)(圖1: A)(Zhou, 2010)。根據功能可把OBPs分為：普通氣味結合蛋白(general odorant-binding proteins, GOBPs)、性信息素結合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)和觸角特異性蛋白(antennae specific proteins, ASPs)，早期研究認為GOBPs主要識別和結合普通氣味分子，PBPs和ASPs主要識別和結合昆蟲性信息素，其中ASPs是特異分布于觸角的嗅覺結合蛋白(Zhouetal., 2009)。但是，隨著研究的深入，研究者發現GOBPs, PBPs和ASPs識別的分子都具有廣譜性，它們既可以識別普通氣味分子也可以識別昆蟲信息素，而且一個配基可以被多種蛋白結合，只是偏向于與特定的分子結合來發揮功能(吳帆等, 2016; Li FQetal., 2019; Wuetal., 2019a)。所以，OBPs的這種分類方式可能存在一定局限性。

圖1 昆蟲嗅覺結合蛋白三維結構模型示例Fig. 1 Examples of the 3D structure of olfactory binding proteins in insectsA: 意大利蜜蜂嗅覺結合蛋白AmelASP1三維結構3D structure of Apis mellifera ligustica olfactory binding protein AmelASP1 (Pesenti et al., 2008); B: 家蠶化學感受蛋白BmorCSP1三維結構3D structure of Bombxy mori chemosensory protein BmorCSP1 (Jansen et al., 2007); C: 日本弓背蟻尼曼-匹克C2型蛋白CjapNPC2三維結構3D structure of Camponotus japonicus Niemann-Pick type C2 protein CjapNPC2 (Ishida et al., 2014).

根據保守的半胱氨酸數量則可把OBPs家族分為：經典OBPs(classical OBPs)、多半胱氨酸OBPs(plus-C OBPs)、少半胱氨酸OBP(minus-C OBPs)和非典型OBPs(atypical OBPs)(表1)(Fanetal., 2011)。保守Cys形成的二硫鍵是影響和維持蛋白結構的主要原因之一。一般情況，6個及以上Cys形成3個二硫鍵，而4～5個Cys只形成2個二硫鍵。

表1 根據半胱氨酸(Cys)殘基數對昆蟲OBPs家族分類[改自Fan等(2011)]Table 1 Classification of OBPs family according to the number of cysteine (Cys) residues (adapted from Fan et al., 2011)

目前，利用X-射線晶體衍射和核磁共振等技術在昆蟲中已經分析獲得了20多個OBPs的三維結構，相關信息可以在蛋白質數據庫PDB(https:∥www.rcsb.org/)中查詢，它們均是以α-螺旋為基礎的球形結構(Britoetal., 2016; 杜亞麗等, 2020)。

1.2 化學感受蛋白

CSPs是昆蟲中發現的第2類嗅覺結合蛋白(圖1: B)。1994年，McKenna等在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中首次發現CSPs基因，可能與化學感受功能相關，其蛋白被命名為OS-D (McKennaetal., 1994)。直到1999年，Angeli等在沙漠蝗Schistocercagregaria中發現類似的序列，確定其與信息素識別相關，命名為CSPs(Angelietal., 1999)。CSPs分子量較OBPs稍小，但同樣具有α-螺旋和保守的Cys。CSPs一般只存在4個保守的Cys位點，形成2個二硫鍵來維持三級結構穩定(Sanchez-Graciaetal., 2009)。相對于OBPs，CSPs在進化上高度保守，不同物種間相似性也很高，比例高達40%～50%，高度保守性可能是CSPs數量比OBPs少的原因之一(Wanneretal., 2004)。CSPs編碼基因在物種基因組中常常成簇出現，這也支持它們可能由相同基因進化而來的觀點。在不同物種中，CSPs數量相差較大，如意大利蜜蜂Apismelliferaligustica有6個，家蠶Bombyxmori有22個(Foretetal., 2007; Gongetal., 2007)。目前，在昆蟲中僅有甘藍夜蛾MamestrabrassicaeMbraCSP2(MbraCSPA6)、沙漠蝗SgreCSP4和家蠶BmorCSP1(圖1: B)3個CSPs蛋白結構獲得解析(Lartigueetal., 2002; Tomasellietal., 2006; Jansenetal., 2007)。

1.3 尼曼-匹克C2型蛋白

NPC2最早是在脊椎動物中鑒定的蛋白，主要功能是負責轉運膽固醇和脂類物質，與一些膽固醇異常的疾病發生相關(Storch and Xu, 2009)。后來，研究者在節肢動物門中的多個物種中發現NPC2，其中以螯肢動物最具有代表性，且昆蟲NPC2分析表明其功能與OBPs有較高的相似性(Pelosietal., 2014a)，進而被認為是第3類具有昆蟲嗅覺結合功能的蛋白。進化分析顯示NPC2在節肢動物中是比OBPs和CSPs更早出現的可溶性蛋白分子(Vizuetaetal., 2020)。與OBPs和CSPs不同的是，昆蟲中NPC2二級結構主要為β折疊(圖1: C)，在此基礎上形成了比OBPs和CSPs更大的內部結合腔(Ishidaetal., 2014)。同時，NPC2序列中也存在保守的Cys，數量在4～6個不等，可以形成2～3個二硫鍵來維持其穩定的三級結構(Zhuetal., 2018)。目前，在昆蟲中僅有日本弓背蟻Camponotusjaponicus的CjapNPC2蛋白三維結構得到解析(Ishidaetal., 2014)。我們知道，OBPs和CSPs在昆蟲中的二級結構主要是α螺旋，在哺乳動物中主要是β折疊(Pelosietal., 2014a)。但是，NPC2在昆蟲和哺乳動物中的二級結構都是以β折疊為主。

1.4 影響嗅覺結合蛋白結構的外界因素

除了蛋白序列外，嗅覺結合蛋白結構還會受到其他因素的影響。第一，pH影響蛋白結構。對意大利蜜蜂氣味結合蛋白OBP1結構分析發現，在pH為4.0, 5.5和7.0時，其結構和對配基的結合力都存在差異，在低pH時OBP1對蜂王信息素9-ODA結合力更強(Pesentietal., 2008)。這一結果與家蠶性信息素結合蛋白BmorPBP和岡比亞按蚊Anophelesgambiae氣味結合蛋白AgamOBP1相反，它們在高pH時的結構更利于配基結合(Leeetal., 2002; Wogulisetal., 2006)。當到達嗅覺受體后，通過pH調節還可以促使氣味結合蛋白釋放配基來激活受體，這種通過pH調節結合力的現象對它們發揮功能十分重要(Yuetal., 2018)。第二，配基結合影響蛋白結構。意大利蜜蜂OBP14在與1-NPN、丁香酚、檸檬腈和溴化鉭等配基結合后，其自身結構會發生改變(Spinellietal., 2012)。由于氣味結合蛋白經常以二聚體形式發揮作用，這就導致一個配基結合后可能會影響其他配基的結合(Weietal., 2020)。第三，氨基酸位點突變影響蛋白結構和功能。蛋白質氨基酸序列決定其高級結構，所以氨基酸突變會影響蛋白構象，改變其配基結合力，特別是重要的氨基酸(Lietal., 2020)。比如，保守的Cys和能形成氫鍵的氨基酸改變對蛋白結合功能有重要影響(Spinellietal., 2012; Songetal., 2018)。研究表明，嗅覺結合蛋白的突變體只出現在昆蟲特定的一些組織中，這就可能與特異功能密切相關(Xuanetal., 2014)。在大草蛉ChrysopapallensCpalOBP4蛋白氨基酸定點突變實驗中，研究者也發現其關鍵氨基酸突變影響其對法尼醇等配基的結合力(Li TTetal., 2019)。第四，溫度變化影響嗅覺結合蛋白對配基結合力。體外結合實驗結果表明OBPs和CSPs與配基結合力受溫度變化影響(Wuetal., 2019a)。大部分昆蟲是變溫動物，體溫隨外界環境變化而改變，但體內嗅覺結合蛋白與配基結合是否受影響還未見相關報道。

1.5 嗅覺結合蛋白作用機制

對于嗅覺結合蛋白結合、轉運和釋放配基分子作用機制的研究比較欠缺，理論研究還不完善且存在一定的爭議。目前，嗅覺結合蛋白的作用機制主要有兩種假說：pH依賴的調控機制和配基分子誘導的構象變化機制，其中pH依賴的嗅覺結合蛋白作用機制是主流觀點。上面我們提到，在不同pH下，嗅覺結合蛋白對配基的結合力不同，特別是低pH降低結合力，這就暗示pH能夠影響配基的結合和釋放(Pesentietal., 2008; Leal, 2013, Fuetal., 2018)。進一步研究推測，觸角淋巴液內的pH可能不是均一的，而是pH值變化的環境，“嗅覺結合蛋白-配基”復合物在淋巴液中的運輸也受變化的pH調節，但在昆蟲觸角內并未得到證實(Dambergeretal., 2013)。如果能夠通過理化技術證明觸角淋巴液內pH是變化的，將有利于我們認知嗅覺結合蛋白的作用機制。另一種觀點認為配基分子誘導的蛋白構象變化是嗅覺蛋白發揮作用的方式。我們知道，嗅覺結合蛋白對配基的結合具有廣譜性，主要是其內部有一個疏水結合腔。反過來，氣味或信息素分子也可以調節嗅覺結合蛋白結構改變，這種構象變化一方面使蛋白更好地與配基結合，另一方面，變化的嗅覺結合蛋白可以幫助配基靶向激活受體(Laughlinetal., 2008)。這種依賴嗅覺結合蛋白結合和轉運的機制不僅適合多種氣味和信息素分子進入觸角，而且可以有效地防止它們被淋巴液中的氣味/信息素降解酶(odorant/pheromone degrading enzymes, ODEs/PDEs)所降解，對嗅覺系統十分重要。

但是，也有觀點認為部分疏水性外源分子到達受體過程中并不需要嗅覺結合蛋白的協助。在果蠅觸角中，敲除高豐度表達的OBPs基因后，其觸角上的不同感受器對外源氣味信號的反應依然很強(Xiaoetal., 2019)。結構研究發現，在嗅覺感受器上分布著很多微孔小管(pore tubules)，每個感受器上平均約有83 000個，一些外源分子可以直接通過微孔小管擴散到達嗅覺受體，整個過程不需要嗅覺結合蛋白參與(Kaisslingetal., 1987; Larteretal., 2016)。不同感受器的結構和物質組成不同，比如，黑腹果蠅錐形感器上就分布著很多微孔小管，但其毛形感器上卻沒有微孔小管，而是高表達OBP76a蛋白，說明同一物種的不同感受器之間嗅覺作用機制也存在差異(Shanbhagetal., 2000)。

2 嗅覺結合蛋白的表達與分布

早期對嗅覺結合蛋白的研究主要都集中在昆蟲的嗅覺感受器上，發現其在感受器淋巴液中高濃度表達(Klein, 1987)。在膜翅目、鱗翅目和雙翅目等昆蟲中最先發現的都是PBP，發現它們在雌雄蟲中差異或特異表達，能夠識別信息素類物質，如膜翅目意大利蜜蜂ASP1(Briandetal., 2001)，鱗翅目黃地老虎AgrotissegetumPBP(LaForestetal., 1999)。在研究昆蟲寄生和取食等行為時在觸角中又發現了大量的GOBPs，與識別植物源氣味有關(Vogtetal., 1991)。后來，研究者發現OBPs在昆蟲觸角以外的組織中也有表達(李正西和Zhou, 2004; 李廣偉等, 2017)。隨著高通量測序和蛋白質組學的快速發展，加快了對嗅覺結合蛋白的研究(孟翔等, 2016)。在意大利蜜蜂中，總共存在21個OBPs，有13個在觸角中有表達，其中在觸角中特異表達的只有2個，其他的OBPs在腦、胸、卵巢和不同日齡幼蟲中均有表達(Foret and Maleszka, 2006)。我們知道，影響嗅覺結合蛋白功能的兩個因素是：表達豐度和結合能力，有些OBPs只在非嗅覺器官中表達，可能與特定功能有關，這將在蛋白功能部分詳細介紹。

相較于OBPs，CSPs的分布則更加廣泛，如在昆蟲頭部、跗節、下唇須、卵巢、腺體和表皮等都有表達。一方面是由于化學感受的感受器分布廣泛，在昆蟲體表毛發、跗節、口器和翅中均有化學感受器存在(張玉等, 2019)；另一方面是因為CSPs自身功能的多樣性。意大利蜜蜂基因組分析確定了6個CSPs，其中CSP5和CSP6在觸角中不表達，除了CSP5特異在蜂王卵巢和卵中表達外，其他CSPs在蜜蜂不同組織和發育不同階段廣泛表達(Foretetal., 2007)。家蠶中有22個CSPs，這些基因從卵到不同日齡幼蟲、以及成蟲腦、表皮、脂肪體、中腸和精/卵巢中都有分布，不同基因在時空上差異表達(Gongetal., 2007)。

目前，NPC2在昆蟲中的研究還比較少。昆蟲中，僅在膜翅目(意大利蜜蜂、中華蜜蜂Apisceranacerana、日本弓背蟻、中紅側溝繭蜂Microplitismediator)(Ishidaetal., 2014; Leeetal., 2014; Iovinellaetal., 2018; Zhengetal., 2018)、雙翅目(岡比亞按蚊、埃及伊蚊Aedesaegypti、黑腹果蠅、柑橘大果蠅Bactroceraminax)(Shietal., 2012; Caicedoetal., 2019; 陳劍等, 2020)、鱗翅目(棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、柞蠶Antheraeapernyi)(Zhuetal., 2018; Chenetal., 2020)、半翅目(黑肩綠盲蝽Cyrtorhinuslividipennis)(Wangetal., 2018)等4目11個種中發現了NPC2家族基因，數量也很少。這些基因功能研究很少，在昆蟲中的時空表達也還缺少研究。但是，綜合這些昆蟲物種的數據以及哺乳動物的數據，我們可以確定NPC2基因在昆蟲嗅覺器官和非嗅覺器官中都有表達，功能也各不相同。

3 嗅覺結合蛋白的功能

經過40年的研究，昆蟲中嗅覺結合蛋白家族成員不斷擴大。由于其相對簡單而穩定的結構，使其能適應各種環境和任務，所以這些蛋白的功能復雜多樣，且這些功能對昆蟲生理和行為尤為重要。

3.1 識別轉運外源氣味和信息素分子

作為嗅覺結合蛋白，最初研究它們的功能就是在嗅覺系統中結合轉運氣味和信息素分子。OBPs, CSPs和NPC2均為球狀結構，親水性氨基酸分布于蛋白表面，使它們具有強水溶性，疏水性氨基酸在內部形成空腔，用于結合配基(Lartigueetal., 2002; Zhou, 2010)。疏水性的氣味分子或信息素分子無法穿過淋巴液，所以在嗅覺結合蛋白的協助下到達嗅覺受體(Leal, 2013)。在意大利蜜蜂中，ASP1可以轉運蜂王信息素HOB到達嗅覺受體(odor receptors, ORs)OR11(Briandetal., 2001; Wanneretal., 2007)。但是，嗅覺結合蛋白并不是簡單地被動轉運，它們可以識別不同的氣味或信息素分子。研究發現，OBPs, CSPs和NPC2對配基結合雖然都有廣譜性，但與不同分子的結合力不同(Wuetal., 2019a)。比如，意大利蜜蜂中大多數OBPs和CSPs都能和幼蟲信息素β-羅勒烯和別羅勒烯結合，其中CSP4與兩者結合力最強，且CSP4高表達的個體對幼蟲識別能力更強，有利于幼蟲識別和蜂王漿高產(Wuetal., 2019b)。所以，嗅覺結合蛋白可以特異識別和轉運氣味和信息素分子。

3.2 協助激活受體

嗅覺結合蛋白可以協助氣味分子激活昆蟲嗅覺受體。研究表明，昆蟲嗅覺受體是一種配體門控離子通道，配基與受體結合后激活信號通路(Satoetal., 2008; Leal, 2013)。大多數配基都是直接激活嗅覺受體，但部分受體激活則需要嗅覺結合蛋白的參與，即形成“嗅覺結合蛋白-氣味復合物”發揮作用(Leal, 2013)。LUSH(DmelOBP76a)是黑腹果蠅中第一個功能明確的氣味結合蛋白，對信息素識別十分重要。研究發現，LUSH缺失型個體對信息素Z11-18OAc沒有反應，只有LUSH存在時才能引起神經刺激，說明LUSH能夠協助Z11-18OAc激活受體(Xuetal., 2005)。后續研究發現，黑腹果蠅雄性信息素成分順式-Vaccenyl acetate也是通過與LUSH形成復合物來激活受體的(Laughlinetal., 2008)。目前，LUSH是唯一報道可以協助激活受體的氣味結合蛋白，在其他昆蟲中還未見需要氣味結合蛋白協助來激活受體的報道。

3.3 緩沖作用

嗅覺結合蛋白依靠結合能力緩沖局部環境中某些分子的快速變化。在昆蟲中，一些嗅覺結合蛋白在嗅覺器官中高豐度表達，但并沒有轉運外源分子的作用(Pelosietal., 2018a)。黑腹果蠅觸角錐形感受器中OBP28a是唯一高豐度表達的氣味結合蛋白，敲除后并不影響其嗅覺反應，而是在觸角起到緩沖作用，即“增益控制”作用(Larteretal., 2016)。進一步研究發現，OBP28a在觸角中緩沖的主要對象是β-紫羅蘭酮等多種植物源氣味分子，以防止這些物質的反復刺激(Gonzalezetal., 2020)。增益控制對于昆蟲的任何感受系統都是必不可少的，比如昆蟲對溫度變化的調節以及昆蟲腦中信號通路的調節(Tichyetal., 2008; Serranoetal., 2013)。在嗅覺系統下游，嗅覺受體神經元也是通過增益控制來調節神經活動，以防止神經系統的持續興奮并提高嗅覺編碼的靈敏度(Gorur-Shandilyaetal., 2017; Kadakia and Emonet, 2019)。緩沖作用對昆蟲生理具有重要意義。

3.4 轉運和釋放內源信息素

昆蟲體內分布很多腺體，部分嗅覺相關蛋白在昆蟲腺體中高表達或特異表達，可以協助腺體中的信息素釋放。我們知道，昆蟲信息素極其豐富，在種間和種內的化學通訊中起到重要作用(Slessoretal., 2005)。在蜜蜂中，蛋白質組結果顯示有9個OBPs和2個CSPs在下頜腺有分布(Danietal., 2010; Iovinellaetal., 2011)。對家蠶研究發現，7個CSPs在雌蟲性信息素腺體中表達(Danietal., 2011)。序列分析發現，信息素腺體中CSPs還存在大量突變體，能讓它們結合更多的配基(Xuanetal., 2014)。對黑腹果蠅雄蟲的精液研究發現，其中存在6種OBPs，可以結合雄性信息素成分順式-vaccenyl acetate (Dyanov and Dzitoeva, 1995; Takemori and Yamamoto, 2009)。在棉鈴蟲雄蟲精液中富含高豐度的OBP10，其在交配過程中會由雄蟲轉移到雌蟲體內，最終會留在受精卵表面(Sunetal., 2012)。東亞飛蝗Locustamigratoria雄蟲生殖器中含有很多CSPs蛋白，其中一個高豐度的LmigCSP91可以較好地結合α-萘基丙腈和β-萘基丙腈(Banetal., 2013; Zhouetal., 2013)。除了性腺和生殖腺外，膜翅目昆蟲的毒液腺中也發現了OBPs和CSPs。比如，在寄生蜂Leptopilinaheterotoma和Pteromaluspuparum的毒腺中都發現OBPs和CSPs的存在，可能與毒液分泌有關(Heavneretal., 2013; Wangetal., 2015)。蛋白質組分析顯示意大利蜜蜂毒腺中存在OBP21，但尚不清楚其功能(Lietal., 2013)。在甘藍夜蛾、小地老虎Agrotisipsilon和埃及伊蚊等的腺體中也發現了OBPs和CSPs(Pelosietal., 2014a)。所以，嗅覺結合蛋白在信息素合成和分泌過程中發揮作用。

3.5 發育、修復和組織再生

OBPs和CSPs參與到昆蟲個體發育，甚至是組織再生。最早研究嗅覺結合蛋白與發育相關的是美洲大蠊Periplanetaamericana，發現在其足的再生過程中，PameP10的表達量顯著上調(Nomuraetal., 1992; Kitabayashietal., 1998)。在意大利蜜蜂中，轉錄組數據顯示CSP5在卵巢和卵中特異表達，與胚胎的正常發育密切相關(Foretetal., 2007; Maleszkaetal., 2007)。在紅火蟻Solenopsisinvicta中，其Si-CSP9在3日齡幼蟲中高表達，通過影響脂肪酸的生物合成以及其他代謝通路調節角質層的發育和蛻皮(Chengetal., 2015)。在埃及伊蚊中，AaegOBP1, AaegOBP11, AaegOBP13, AaegOBP44和AaegOBP45可能與卵膜的形成有關，但具體的調控機制尚不清楚(Amenyaetal., 2010; Costa-da-Silvaetal., 2013)。在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中，SexiCSP3在雌蟲生殖器中表達量高于雄蟲，RNAi干擾后會抑制其產卵能力，而且卵的孵化率顯著降低，說明其參與卵的形成和發育(Gongetal., 2012)。對沙漠飛蝗散居和群居個體的比較中，發現兩者生理和行為方面有很大的差異，但卻可以相互轉化，這個轉化過程與CSPs的表達變化密切相關(Guoetal., 2011)。

3.6 抗炎免疫活性

嗅覺結合蛋白的抗炎免疫作用是研究者在吸血類昆蟲中發現的。蚊蟲叮咬后，宿主自身的免疫反應會使血液凝集以防止吸血，研究發現斯氏按蚊Anophelesstephensi唾液中的一些OBPs起到血液抗凝劑的作用，防止進食中斷(Isawaetal., 2002)。蚊蟲取食過程中，宿主會分泌去甲腎上腺素和5-羥色胺等生物胺類物質，可引起腫脹、紅斑和瘙癢等癥狀，在岡比亞按蚊和埃及伊蚊的唾液中含有一些OBPs，它們對這些生物胺有很強的親和力，通過抑制宿主炎癥反應可以使取食順利進行(Mansetal., 2007; Calvoetal., 2009)。對黑腹果蠅研究發現，過表達的NPC2a和NPC2e可以通過雙翅殺菌肽啟動子來激活其先天免疫(Shietal., 2012)。此外，埃及伊蚊和白蛉Phlebotomusargentipes中一些D7相關蛋白和OBPs有相似結構，具有免疫原性(Martín-Martínetal., 2013; Oktariantietal., 2015)。對中華蜜蜂NPC2功能分析時，發現細菌和真菌感染初期AcNPC2a在激發先天免疫方面也發揮重要作用(Leeetal., 2014)。在埃及伊蚊中，NPC2對其降低登革熱病毒感染方面效果顯著(Caicedoetal., 2019)。這些作用的信號通路和調控過程還不清楚，相關功能和調節機制需要進一步研究。

3.7 耐藥性作用

昆蟲防治面臨的主要問題之一就是耐藥性，而耐藥性的產生一個原因可能與嗅覺結合蛋白有關。用阿維菌素處理家蠶時，它們體內20個CSPs在不同組織中增強表達，部分蛋白對阿維菌素還有較好的親和力(Xuanetal., 2015)。用亞致死劑量的新煙堿類殺蟲劑防治煙粉虱Bemisiatabaci時，其BtabCSP1在腹部表達量升高(Liu GXetal., 2014)。對于小菜蛾Plutellaxylostella，用汴氯菊酯處理后其體內OBP13, CSP4和CSP8表達量增高(Bautistaetal., 2015)。這些蛋白一方面直接結合農藥分子起到抗藥性作用，另一方面可能激活下游信號通路調節耐藥性產生。目前，研究者只是發現殺蟲劑處理后嗅覺結合蛋白表達量增加，但是這些蛋白調控耐藥性的機制尚不清楚(Pelosietal., 2018a)。

3.8 味覺和營養功能

昆蟲嗅覺結合蛋白在味覺器官中高表達，可能參與攝食和營養吸收等功能(Sanchez-Graciaetal., 2009)。首先，昆蟲嗅覺結合蛋白可以幫助昆蟲攝取疏水性物質。對綠頭蠅Phormiaregina研究發現，它們喜食富含脂肪酸的腐肉，但這些脂肪酸不溶于水，而其味覺中的PregOBP57a可能通過pH變化來攝取脂肪酸類物質(Ishidaetal., 2013)。在棉鈴蟲中，HarmCSP4在口器中高表達，能夠結合疏水性成分β-胡羅卜素來攝取營養(Zhuetal., 2016)。其次，昆蟲嗅覺結合蛋白可以協助取食過程。在一些飛蛾和蝴蝶中，發現它們口器中CSPs含量很高。比如，甘藍夜蛾的口器中CSPs大量表達，它們在取食過程中調節宿主的生理狀況，以便甘藍夜蛾取食(Nagnan-Le Meillouretal., 2000)。在棉鈴蟲和煙青蟲Helicoverpaassulta成蟲喙中，CSP4大量表達，在其吸吮葉汁時分泌CSP4來降低靜水壓保證攝食過程順利進行(Liu YLetal., 2014)。最后，嗅覺結合蛋白對一些重要的營養物質具有高親和力。對于黑腹果蠅來說，L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺是必需氨基酸，其體內分布的OBP19b對這些物質具有高親和力，有利于快速結合和轉運這兩種氨基酸(Rihanietal., 2019)。對一些吸血類昆蟲的研究發現，它們嗜血行為可能與CSPs基因家族進化有關，影響了它們的取食習慣(Freitas and Nery, 2020)。

4 嗅覺結合蛋白的應用

4.1 生物防治與物種保護

眾所周知，嗅覺系統在昆蟲覓食、尋偶交配和尋找寄主等方面都發揮著重要作用(Leal, 2013)。昆蟲種類繁多，但大部分都是農林害蟲。因此，我們可以通過嗅覺系統的特性利用反向化學生態學的方法研究生物防治的策略。

基于昆蟲嗅覺設計的生物防治有誘殺和毒殺兩種方式。誘殺是利用昆蟲信息素來進行引誘防治(Brandetal., 1979)。褐翅椿象Plautiastali是一種為害水果和蔬菜的農業害蟲，研究者根據其聚集信息素成分合成的物質methyl (E,E,Z)-2,4,6-decatrienoate可以高效引誘雌雄蟲，進而設計陷阱捕殺(Jangetal., 2011)。豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的主要性信息素成分為(4aS,7S,7aR)-nepetalactone和(1R,4aS,7S,7aR)-nepetalactol，它們對豌豆蚜有顯著的引誘作用，可以通過合成其性信息素或類似物來進行誘殺(Nakashimaetal., 2016)。毒殺是通過一些物質抑制或阻斷昆蟲嗅覺系統信號傳遞，即可以根據昆蟲嗅覺結合蛋白的結合特性設計與其結合力強的殺蟲劑分子(Pelosietal., 2018a)。二點委夜蛾Athetislepigone體內有兩個氣味結合蛋白AlepOBP1和AlepOBP2，AlepOBP1對殺蟲劑毒死蜱和肟硫磷有強結合力，AlepOBP2與性信息素(Z)-7-dodecenyl acetate和(Z)-9-tetradecenyl acetate結合，可以人工合成同時具有AlepOBP1和AlepOBP2蛋白結構的分子對其進行防治(Zhangetal., 2020)。(E)-β-法尼烯是豌豆蚜重要的報警信息素，可以用于防治豌豆蚜，但由于其易揮發和氧化，所以難以推廣和應用。研究者根據(E)-β-法尼烯的結構合成其類似物，同時在其上加上殺蟲劑的吡唑結構，使其具有高效的殺蟲效果(Sunetal., 2011)。

值得注意的是，在生物防治的過程中，我們要形成保護益蟲的意識。對中華蜜蜂嗅覺研究發現，新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉能夠影響ASP2對氣味分子的識別能力，可能導致嗅覺反應遲鈍(Lietal., 2015)，類似的情況在中華蜜蜂CSP1(Lietal., 2017a)和茶尺蠖EctropisobliquaGOBP2蛋白中也有發現(Lietal., 2017b)。所以，農藥對嗅覺結合蛋白的影響具有兩面性：即可毒殺害蟲也可能損害益蟲的嗅覺感受系統。研究者在設計農藥時不僅要考慮防治害蟲，還要考慮不要對益蟲產生影響，以提高殺蟲劑的特異性。

4.2 用于品種選育的分子標記

利用分子標記輔助育種在動植品種選育方面都有應用，嗅覺結合蛋白也是一種重要的標記物。對意大利蜜蜂研究發現，其工蜂通過觸角中CSP4識別幼蟲信息素β-羅勒烯和別羅勒烯來哺育幼蟲，如果通過選育CSP4蛋白高表達的蜜蜂品系則有利于幫助培育出蜂王漿高產的蜜蜂(Wuetal., 2019b)。在選育的意大利蜜蜂中，發現清理行為強的蜜蜂觸角中OBP17和OBP18高表達，它們可能通過這兩個蛋白識別病原微生物來減少蜂群的致病率(Huetal., 2016)。這種通過嗅覺結合蛋白選育的蜜蜂在高產和抗病方面發揮重要作用。在此基礎上，研究者通過利用分子建模、分子對接和系統發育等方法，建立了一種快速分析蜜蜂氣味結合蛋白與氣味分子的配對模式，如OBP16-N-phenyl-2-napthalamine、OBP1-可卡因、OBP10-美沙酮、OBP2-大麻之間有較好親和力，這不僅給選育提供了新的方向而且加快了選育過程，可以通過選育和訓練使蜜蜂能夠識別毒品和炸藥類物質，進而在實踐中得以應用(Langeswaranetal., 2018)。目前，基于嗅覺結合蛋白選育新的品系只在益蟲(蜜蜂、家蠶等)中有研究，在害蟲中還未見報道。

4.3 制作生物傳感器

自嗅覺結合蛋白發現后，研究者一直希望通過它們的特異性和靈敏性設計高效的生物傳感器。通過細菌表達昆蟲嗅覺結合蛋白，再利用理化方法偶聯在感應裝置上來檢測特定物質，檢測能力都在微摩爾范圍內(Pelosietal., 2014b)。作為模式生物，對蜜蜂嗅覺蛋白的配基結合譜的研究較多，其中OBP2(ASP2)和OBP14已經被制作成生物傳感器用來檢測環境中氣味分子的變化(Luetal., 2014; Larisikaetal., 2015)。在黑腹果蠅中，LUSH對醇類物質有很好的識別能力，利用其設計的生物傳感器已經用來檢測火腿和牛肉中沙門氏菌的含量(Sankaranetal., 2011; Sonetal., 2016)。利用岡比亞按蚊AgamOBP1重組表達蛋白設計的傳感器，可以用來測試大腸菌群特征代謝物吲哚的存在，進而分析飲用水污染情況(Dimitratosetal., 2019)。此外，AgamOBP1的突變體與大麻、搖頭丸和可卡因等毒品成分有很高親和力(Khasim and Krishna, 2020)，這在功能上與蜜蜂的氣味結合蛋白有相似之處(Langeswaranetal., 2018)，也是作為開發新型生物嗅覺檢測器的潛在蛋白。這些結果都充分說明利用嗅覺結合蛋白設計生物傳感器的可行性與巨大的應用價值。

但是，由于對嗅覺編碼認知的局限性以及缺乏有效的嗅覺感應元件，所以嗅覺傳感器一直沒有得到廣泛應用。第一，嗅覺編碼十分復雜，我們對嗅覺蛋白的配基結合譜的研究還不足。對已經研究的嗅覺結合蛋白分析發現，一個蛋白可以識別和結合多種配基，而一個配基也可以被多種蛋白結合，這就導致檢測準確性降低 (Li FQetal., 2019; Wuetal., 2019a)。如果要利用這些蛋白制作傳感器，就需要找到它們特異且高親和的配基分子。第二，需要開發有效的嗅覺感應元件。目前，在傳感器中使用的感應方法包括電化學阻抗法等，雖然檢測能力達到微摩爾水平，但與昆蟲的識別能力還有很大的差距(Luetal., 2014; Pelosietal., 2018b)。最近，研究者利用硅納米線(silicon nanowire, SiNW)制作的生物傳感器的檢測限已經達到十億分之一，在檢測能力上有了很大進步，可能具有廣泛的應用前景(Gao, 2020)。此外，很多感應元件還存在攜帶不便、使用麻煩和制作困難等缺點，特別是實驗室之外使用難度大，這就造成嗅覺結合蛋白在傳感應用方面的局限性。因此，科研工作者在未來研究中需要探索更高效的生物傳感裝置。

5 結語

昆蟲嗅覺系統極其靈敏，這與其嗅覺結合蛋白密切相關。在昆蟲中鑒定的嗅覺結合蛋白已經超過600個，它們結構復雜且在昆蟲體內分布范圍廣泛，功能多樣，具有巨大的潛在應用價值。但是，相關的研究還遠遠不足，未來對嗅覺結合蛋白結構、功能以及發揮作用的機制應該是研究的重點。如果深入研究，那么基于昆蟲嗅覺結合蛋白的生物防治、資源選育和生物嗅覺傳感器等都具有廣泛的應用前景。