白僵蠶多糖的含量測定方法

洪佳青，但彩云，崔詩遙，劉 雪，李文樂，金 潔，時連根

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

多糖（Polysaccharides）是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵相連接的一類天然大分子聚合物，廣泛存在于植物、動物、微生物、地衣、海藻等中，是構成生命的分子基礎之一。20世紀60年代以后，多糖作為一種理想的生物效應調節劑（Biological Response Modifi?ers，BRM）引起了人們的極大興趣［1］；80年代以后，多糖被認為在細胞識別、控制細胞的分裂和分化等分子生物學方面起著極其重要的決定作用［2］。越來越多的研究表明，多糖具有提高免疫能力［3，4］、抗腫瘤［5～7］、抗氧化、抗感染［8～10］、抗輻射和降血糖、降血脂［11］等多種生物活性，而對正常細胞的毒副作用卻很小［12］。因此，多糖的應用為惡性腫瘤、艾滋病和其他多種疾病的治療開辟了新的方向，也吸引越來越多的研究者期望從天然產物中尋找活性更高、更為有效的多糖。

白僵蠶（Bombyxbatryticatus）是家蠶（Bombyx mori）幼蟲感染病原白僵菌（Beauveriabassiana）而僵死的干燥菌蟲復合體，為我國傳統的名貴中藥材，始載于《神農本草經》中，味咸辛，性平，用于治療癲癇、高熱驚厥、流行性腮腺炎、上呼吸道感染、遺尿等疾病［13，14］。現代藥理學研究表明，白僵蠶富含多糖、白僵菌素、草酸銨、黃酮類化合物、活性蛋白質、酶、氨基酸、維生素、微量元素、有機酸等多種活性成分，具有鎮定、退熱、止咳化痰、消腫、松弛肌肉、調節神經系統及脂肪代謝等多種藥理作用［15，16］。但有關白僵蠶中多糖含量的檢測方法，未見有國內外文獻報道。本研究采用正交實驗法進行白僵蠶中多糖提取條件的優化，建立白僵蠶多糖含量測定的分光光度法。

1 材料與方法

1.1 儀器

Ultrospec 3100 Pro分光光度計，美國Amersh?ampharmacia Biotech公司產品；Mettler Toledo B-N天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產品；DL-180超聲波破碎儀，上海申波超聲公司產品；AP-02B真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產品；電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械五廠產品；中藥粉碎機，上海淀久中藥機械制造有限公司產品。

1.2 試劑

葡萄糖、蒽酮、氯仿、正丁醇、濃硫酸、甲醇和乙醇均為分析純，購自中國醫藥上海化學試劑公司。水為雙蒸餾水。

1.3 白僵蠶粉

家蠶品種為“秋豐×白玉”，常規條件下桑葉飼育至5齡起蠶，在蠶體表面噴灑白僵菌分生孢子液（107個/mL），然后置溫度25℃、濕度90%環境下繼續飼養，收集感染白僵菌致死蠶體，置25℃、90%濕度條件下保護，直至蠶體覆滿白色的白僵菌分生孢子，于-70℃冷凍保存。使用時冷凍干燥，低溫超微粉碎，過篩制得不同粗細的白僵蠶粉。

1.4 對照品溶液的制備

精密稱取105℃烘干至恒重的葡萄糖對照品25 mg，置于100 mL容量瓶中，加入雙蒸餾水，溶解并稀釋至刻度，配成質量濃度為0.25 mg/mL的對照品溶液。

1.5 樣品溶液的配制

精密稱取0.2 g白僵蠶粉，置于燒瓶中，加入50 mL 80%乙醇，100℃水浴鍋中回流1 h，抽濾，用熱80%乙醇洗滌2次。濾渣揮發干后，加入20 mL雙重蒸餾水，超聲波處理50 min，100℃水浴中提取60 min，抽濾，濾渣再重復提取1次。合并2次濾液，放在常溫下冷卻，然后轉移到100 mL的容量瓶中，用雙蒸餾水定容，即為樣品溶液。

1.6 蒽酮-硫酸試劑的配制

準確稱取0.33 g蒽酮，加入100 mL濃硫酸，混合搖勻，置于冰箱中，現配先用。

1.7 最大吸收波長的選擇

分別吸取上述對照品溶液和樣品溶液，與蒽酮-硫酸試液顯色后，于400 nm～700 nm全波長掃描，結果均在620 nm處有最大吸收，故選擇620 nm為測定波長。

1.8 多糖含量的測定

精密吸取樣品溶液1 mL，置于10 mL有塞試管中，冰水浴5 min，加入0.2%蒽酮硫酸試液4 mL，搖勻，立即置于沸水浴中15 min，取出用冷水冷卻至室溫，室溫放置10 min左右，于620 nm處測吸光度，以同樣處理的雙蒸水進行空白校正。對照標準曲線的回歸方程，求出多糖含量。

1.9 統計分析

實驗數據用平均數±標準差（Mean±SD）表示，采用SPSS（version 12.0）統計軟件進行t檢驗，Excel 2007繪圖工具進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

分別吸取對照品溶液 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，置于25 mL的容量瓶中，以雙蒸餾水稀釋均勻，得系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液1 mL，以雙蒸餾水為空白對照，按1.8的方法操作，與蒽酮-硫酸試劑顯色后，于620 nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標，繪制多糖的標準吸收曲線（圖1）。以吸光度值（Y）對葡萄糖濃度（X）進行回歸分析，得出其回歸方程為：Y=9.743X+0.010，相關系數R2=0.998。結果表明，葡萄糖濃度在0.01 mg/mL～0.10 mg/mL范圍內，其濃度與對應的吸光度呈現良好的線性關系，符合Lambert-Beer定律，根據吸光度值來計算其含量是可靠的。

2.2 最佳實驗條件的確立

由于水提溫度、超聲波處理時間和水提時間對實驗結果影響較大，所以對這三個因素進行正交試驗，以確定最佳試驗條件，結果如表1所示。結果表明，此三因素對白僵蠶多糖含量測定的影響大小是水提時間（c）>水提溫度（a）>超聲波處理時間（b），比較各因素不同水平的效果，分別是 īa100℃>īa80℃>īa60℃，īb50min>īb40min>īb30min和 īc60min>īb90min>īb30min。為此，在超聲波處理50 min、100℃水提取60 min為白僵蠶多糖提取的理想條件。考察提取次數對白僵蠶多糖提取的影響，結果多糖提取量隨著提取次數的增加而增大，而第4次提取液的吸光度為0。如果將第1-3次多糖提取量的指數定為100%，則第1次、第2次和第3次的多糖提取率分別為91.12%、7.91%和0.97%，即提取2次的多糖提取率已達99%以上。因此，選擇提取2次。

表1 白僵蠶多糖含量測定的正交試驗結果Table 1 The Orthogonal Experimental Result of Polysaccharides Determination

分別用粗磨、過80目篩、過120目篩、160目篩和過200目篩的白僵蠶粉制備樣品液，調查試樣的不同粉碎程度對白僵蠶多糖提取的影響，結果如表2所示。結果表明，白僵蠶的不同粉碎程度在多糖提取效果間存在明顯的差異，其中過160目篩的提取效果最好。

表2 不同粉碎程度對白僵蠶多糖提取效果的影響Table 2 The Effect of Polysaccharides Determination with the Different Crushed Sample

2.3 重現性實驗結果

精密稱取白僵蠶粉5份，每份約0.2 g，按最佳提取條件制備樣品液，分別按1.8的方法進行測定，結果多糖平均含量為11.54 mg/g，RSD=1.02。結果表明測定方法重復性好。

2.4 穩定性實驗結果

取同一批樣品液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按1.8的方法進行測定，結果在24 h內測定多糖的平均含量為11.68 mg/g，RSD=0.89，結果表明多糖提取液在24 h內穩定。

2.5 加樣回收率實驗結果

精密稱取已知含量的白僵蠶粉5份，每份約0.2 g，分別加入一定量的標準多糖，按最佳提取條件制備樣品液，再分別按1.8的方法進行測定，計算平均加樣回收率為99.27%，RSD=2.5，結果表明本測定方法符合加樣回收率的要求。

3 討論

蒽酮-硫酸法測定多糖含量，是利用多糖在濃硫酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成羥甲基糠醛，羥甲基糠醛與蒽酮綜合成藍色化合物，比色該化合物顏色的深淺來計算多糖濃度的高低［17］。本實驗選用80%乙醇回流除去苷類、生物堿等干擾成分，建立了用蒽酮-硫酸試劑顯色、分光光度法來測定白僵蠶中多糖含量的方法，該方法的穩定性、重現性和回收率均符合要求，得出的結果穩定可靠，可作為檢測白僵蠶多糖含量的有效方法之一。

多糖存在于細胞膜或細胞壁中，不同物體中的多糖具有不同的溶解特性。多糖提取有水提、酸提、堿提、酶提等方法，但多糖在熱水中溶解度更大、穩定性更好，所以熱水浸提法是生物多糖最廣泛采用的提取方法［18］。本實驗驗就水提溫度、超聲波處理時間、水提時間、樣品粉碎程度和提取次數等對白僵蠶多糖提取效果的影響進行了比較，結果表明白僵蠶粉過160目篩，超聲波處理50 min后于100℃水回流60 min，重復提取2次，可高效地提取白僵蠶中多糖，研究結果可為白僵蠶多糖的藥理學研究奠定基礎。