miR-92a-3p靶向調(diào)控NOTCH信號(hào)通路對(duì)T-ALL細(xì)胞增殖的影響機(jī)制

胡敏利，應(yīng)雙偉，羅文達(dá)

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院血液腫瘤內(nèi)科，浙江臺(tái)州 317000)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是一種兒童常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其中約有15%為急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)[1-2]，而T淋巴細(xì)胞惡性增殖是T-ALL的重要特征之一[3-4]。微小RNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的非編碼RNA，可通過(guò)靶向相關(guān)基因調(diào)控細(xì)胞增殖，與包括T-ALL在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-8]。miR-92a-3p在T-ALL中異常低表達(dá)[9]，但其是否參與T-ALL細(xì)胞增殖過(guò)程并不清楚。本研究通過(guò)上調(diào)和下調(diào)miR-92a-3p表達(dá)觀察miR-92a-3p對(duì)T-ALL SupT1細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，旨在揭示miR-92a-3p在T-ALL發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

miR-92a-3p模擬物及其抑制劑(貨號(hào)：M-01-S、M-02，上海吉瑪)，果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺口(NOTCH)信號(hào)通路相關(guān)蛋白NOTCH1、Jagged1、Hes1和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(貨號(hào)：ab194123、ab85763、ab108937、ab179467，英國(guó)Abcam)，噻唑藍(lán)(MTT)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(貨號(hào)：M8180、P1200，北京索萊寶)，SYBR Premix Ex Taq試劑盒(貨號(hào)：DRR420A，日本TAKARA)。

1.2 方法

1.2.1分組與處理

實(shí)驗(yàn)分為4組，未轉(zhuǎn)染組：正常培養(yǎng)；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照；模擬物組：轉(zhuǎn)染miR-92a-3p模擬物；抑制劑組：轉(zhuǎn)染miR-92a-3p抑制劑，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將T-ALL SupT1細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在5% CO2、濕度飽和的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SupT1細(xì)胞種植到6孔板上后，培養(yǎng)至70%～80%融合度時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別將miR-92a-3p模擬物、miR-92a-3p抑制劑和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SupT1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，根據(jù)上海生工生物合成的引物，上RT-qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，具體步驟參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-92a-3p表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列，miR-92a-3p正向：5′-CAC TTG TCC CGG CCT GTA AA-3′，反向：5′-TAT TGC ACT TGT CCC GGC CTG-3′；U6正向：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，反向：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。

1.2.3MTT檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SupT1細(xì)胞種植到96孔細(xì)胞板上后，培養(yǎng)至70%融合度時(shí)，按照1.2.1中的分組處理細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后，每孔加入MTT工作液孵育4 h；再加入二甲基亞砜工作液震蕩反應(yīng)15 min。采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)

收集各組SupT1細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(BPS)漂洗2遍后，在4 ℃下使用70%乙醇固定過(guò)夜；BPS漂洗后，加入核糖核酸酶A避光溫浴30 min；經(jīng)碘化丙啶4 ℃下染色30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blot檢測(cè)

抽提待測(cè)SupT1細(xì)胞總蛋白后，采用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)蛋白濃度與純度。將變性后的蛋白樣品行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜；室溫下以5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗工作液(NOTCH1 1∶800、Jagged1 1∶200、Hes1 1∶200和β-actin 1∶1 000)孵育2 h；室溫下辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)孵育2 h后，使用化學(xué)發(fā)光劑顯影，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析SupT1細(xì)胞中NOTCH1、Jagged1和Hes1蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因(DLR)實(shí)驗(yàn)

將與miR-92a-3p互補(bǔ)結(jié)合的NOTCH1 3′UTR序列片段及定點(diǎn)突變后的NOTCH1 3′UTR序列片段克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報(bào)告基因載體上，分別作為NOTCH1野生型(NOTCH1-Wt)和NOTCH1突變型(NOTCH1-Mut)載體質(zhì)粒。將NOTCH1-Wt、NOTCH1-Mut分別與陰性對(duì)照、miR-92a-3p模擬物、miR-92a-3p抑制劑共轉(zhuǎn)染至SupT1細(xì)胞中，其中每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性，具體步驟參照DLR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組SupT1細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平比較

未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、模擬物組、抑制劑組細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平分別為0.97±0.07、1.02±0.09、16.48±2.16、0.19±0.02。與未轉(zhuǎn)染組比較，陰性對(duì)照組SupT1細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對(duì)照組比較，模擬物組SupT1細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平明顯升高，而抑制劑組SupT1細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平明顯降低(F=478.458，P<0.001)。

2.2 各組SupT1細(xì)胞增殖活力比較

與未轉(zhuǎn)染組比較，陰性對(duì)照組不同時(shí)間SupT1細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯變化(P>0.05)；與陰性對(duì)照組比較，模擬物組48、72、96 h后SupT1細(xì)胞增殖活力明顯減弱，而抑制劑組48、72、96 h后SupT1細(xì)胞增殖活力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 各組SupT1細(xì)胞周期分布情況

與未轉(zhuǎn)染組比較，陰性對(duì)照組SupT1細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期所占百分比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對(duì)照組比較，模擬物組SupT1細(xì)胞在G0/G1期所占百分比明顯升高，且在S期和G2/M期所占百分比明顯降低(P<0.05)；而抑制劑組SupT1細(xì)胞在G0/G1期所占百分比明顯低于陰性對(duì)照組，且在S期和G2/M期所占百分比明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

2.4 各組SupT1細(xì)胞中NOTCH信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與未轉(zhuǎn)染組比較，陰性對(duì)照組SupT1細(xì)胞中NOTCH信號(hào)通路相關(guān)蛋白NOTCH1、Jagged1和Hes1表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對(duì)照組比較，模擬物組SupT1細(xì)胞中NOTCH1、Jagged1和Hes1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而抑制劑組SupT1細(xì)胞中NOTCH1、Jagged1和Hes1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖2、表3。

表1 各組SupT1細(xì)胞增殖活力比較

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SupT1細(xì)胞周期分布情況

表2 各組SupT1細(xì)胞周期分布情況比較

1：未轉(zhuǎn)染組；2：陰性對(duì)照組；3：模擬物組；4：抑制劑組。

2.5 miR-92a-3p和NOTCH1靶向關(guān)系預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

miR-92a-3p與NOTCH1 3′UTR存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。與陰性對(duì)照和NOTCH1-Wt共轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，miR-92a-3p模擬物和NOTCH1-Wt共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低，而miR-92a-3p抑制劑和NOTCH1-Wt共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)；但miR-92a-3p模擬物和miR-92a-3p抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)染NOTCH1-Mut細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表3 各組細(xì)胞NOTCH1、Jagged1及Hes1蛋白表達(dá)水平比較

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較

圖3 miR-92a-3p與NOTCH1靶向結(jié)合位點(diǎn)

3 討 論

T-ALL中細(xì)胞增殖影響疾病進(jìn)程，因此，發(fā)現(xiàn)影響T-ALL的基因?qū)τ赥-ALL疾病治療意義重大。miRNA作為短RNA序列，在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中miR-92a-3p是miR-17-92家族成員，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[10]；有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中miR-92a-3p表達(dá)受阻可減弱癌細(xì)胞增殖能力，miR-92a-3p可能是結(jié)直腸癌治療的重要靶點(diǎn)[11]；miR-92a-3p可抑制前體脂肪細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化，與肥胖癥的發(fā)生密切相關(guān)[12]。有學(xué)者在T-ALL中發(fā)現(xiàn)miR-92a-3p表達(dá)下調(diào)[9]，但作用機(jī)制尚不清楚。本研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-92a-3p人T-ALL SupT1細(xì)胞增殖活力明顯降低，G0/G1期所占百分比明顯升高；下調(diào)miR-92a-3p后SupT1細(xì)胞增殖活力明顯增強(qiáng)，且細(xì)胞在S期和G2/M期所占百分比明顯升高。表明上調(diào)miR-92a-3p可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期抑制SupT1細(xì)胞增殖，而下調(diào)miR-92a-3p可通過(guò)加速細(xì)胞周期于S期促進(jìn)SupT1細(xì)胞增殖。提示miR-92a-3p可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖在T-ALL發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著作用。

NOTCH信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，可激活下游Hes家族和p21等靶基因，進(jìn)而在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13-14]，且與T-ALL的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NOTCH信號(hào)通路的活化在T-ALL細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[15]。靶向抑制NOTCH1表達(dá)可影響下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-92a-3p表達(dá)可引起SupT1細(xì)胞中NOTCH1、配體Jagged1及下游Hes1蛋白表達(dá)水平明顯降低，而下調(diào)miR-92a-3p表達(dá)則出現(xiàn)相反的結(jié)果。提示在T-ALL中miR-92a-3p可能通過(guò)抑制NOTCH信號(hào)通路活化進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。miR-92a-3p與NOTCH1 3′UTR存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。提示miR-92a-3p可能通過(guò)靶向NOTCH1抑制NOTCH信號(hào)通路活化進(jìn)而抑制細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制T-ALL細(xì)胞增殖。

綜上所述，miR-92a-3p靶向調(diào)控NOTCH信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而發(fā)揮抑制SupT1細(xì)胞增殖的作用，本文驗(yàn)證miR-92a-3p在T-ALL中的機(jī)制，以為臨床上miR-92a-3p的靶向治療提供依據(jù)。