CD4+T細胞、NK細胞穿孔素異常表達對手足口病免疫狀態評估及預后的指導價值

黃崇剛 陳靜琳 喇海芹

青海省婦女兒童醫院呼吸科（西寧810007）

手足口?。℉FMD）是一種由腸道病毒感染引發的兒童傳染病，病原體主要為腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A16型（CA16）病毒［1］。HFMD大多預后良好，但部分病情較重者可在短時間內出現急性肺水腫、神經系統并發癥甚至死亡。多項研究表明，免疫功能紊亂在HFMD的發生發展中起到重要作用，尋找到一種評估HFMD患兒免疫狀態和病情嚴重程度的敏感指標，對指導臨床治療和改善預后具有重要意義［2］。有研究認為，EV71病毒蛋白表型A3可能是誘導CD4+T細胞活化的主要決定簇，在病毒后期蛋白加工過程A3重新修飾可能會影響CD4+T細胞的增殖狀態，因此CD4+T細胞表達或許能反映HFMD的病情發展［3］。NK細胞穿孔素（PRF）能協助顆粒酶進入靶細胞清除病原體，有學者認為其表達能在一定程度上反映病毒感染程度和預測預后［4］，但具體情況有待進一步研究。本研究通過分析143例EV71型HFMD患兒 體內CD4+T細 胞、NK細胞PRF表 達水平與免疫狀態和預后關系，為探索HFMD發病機制及改善患兒預后提供一定參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2020年6月我院收治的143例EV71型HFMD患兒，納入標準：（1）患兒確診為HFMD，參考《手足口病診療指南（2018年版）》［5］；（2）病程≤3 d；（3）臨床資料完善；（4）患兒家長知情并簽署同意書。排除標準：（1）合并慢肺阻、先天性心臟病、營養不良等基礎疾??；（2）合并嚴重腎臟相關疾病；（3）外院轉入或用藥史不詳患兒；（4）近期有使用過免疫抑制劑或注射免疫球蛋白者。入選患兒按照病情嚴重程度［6］分為普通型組（n=67）、重型組（n=45）和危重型組（n=31），同時按照性別、年齡匹配原則另選體檢正常兒童35例作為對照組，且腸道病毒抗體陰性，無嚴重器質性疾病、代謝異常等。普通型組，男37例，女30例，年齡（1.82±0.92）歲，病程（1.63±0.25）d，其中27例EV71感染，22例CA16感染，18例通用病毒感染；重型組，男24例，女21例，年齡（1.77±0.86）歲，病程（1.72±0.33）d，其中25例EV71感染，13例CA16感染，7例通用病毒感染；危重型組，男17例，女14例，年齡（1.73±0.91）歲，病程（1.86±0.36）d，其中22例EV71感染，7例CA16感染，2例通用病毒感染；對照組，男20例，女15例，年齡（1.72±0.83）歲。各組患兒性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經我院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 方法收集患兒一般臨床資料，如性別、年齡、病程、感染病原體（經肛門拭子和咽拭子RT?PCR檢測確定病毒類型）及各項生理指標參數。于入組第1天采集患兒空腹靜脈血4 mL并置于加入EDTA的抗凝管中，采用全血法配置分析液，FACS Multi SET程序獲得T淋巴細胞亞群（CD3+T、CD4+T、CD8+T）、CD14+單核細胞、CD19+B細胞、NK細胞的絕對計數。將全血采用免疫比濁法檢測血清中疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）及補體（C3、C4）水平。在分離出的單個核細胞中加入表面抗體anti?CD56?APC（CD3+CD8+CTL細胞和CD3?CD56+NK細胞）進行染色，固定、破膜。洗滌后加入PE標記的PRF或顆粒酶B（GrzB）抗體，避光孵育1 h，洗滌，上流式細胞儀（美國BD公司Facs CantoⅡ型）檢測，以PRF或GrzB陽性細胞比率作為PRF或GrzB表達水平。采用小兒危重病例評分（PCIS）、小兒死亡危險評分（PRISMⅢ）評價患兒病情嚴重程度，PCIS評分包括患兒心率、血壓、血氣值、pH、血鈉、血 鉀、有 無 應激 性 潰瘍 等 內容，總分100分［7］；PRISMⅢ評分包括體溫、心率、瞳孔反射、血壓、血氣值、血鉀、血細胞計數等26個生理參數［8］，兩者均為分數越高病情越嚴重，死亡風險越高。將入院28 d內死亡作為預后不良，分析不同預后患兒CD4+T、NK細胞PRF表達差異。所有患兒均由我院2名副主任及以上級別醫師進行疾病診斷和病情評估。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0軟件包分析數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用snk?q檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組T細胞、單核細胞水平比較重癥組、危重型組、普通型組患兒CD3+T、CD4+T、CD14+細胞數低于對照組，其中重癥組、危重型組低于普通型組，差異具有統計學意義（P<0.05），重癥組、危重型組、普通型組患兒CD8+T細胞數組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組免疫細胞水平比較Tab.1 Comparison of immune cell levels in each group ±s，cells/μL

表1 各組免疫細胞水平比較Tab.1 Comparison of immune cell levels in each group ±s，cells/μL

注：與對照組比較，*P<0.05；與普通型比較，#P<0.05

組別危重型組重型組普通型組對照組例數31 45 67 35 CD4+T 630.2±126.7*#1 026.7±163.8*#1 137.5±149.5*1 682.2±123.4 CD3+T 1 776.2±384.2*#2 169.4±391.5*#2 483.2±368.7*3 794.2±494.3 CD8+T 764.2±170.8*796.3±124.2*834.2±253.6*1 174.2±493.5 CD14+340.5±74.7*#426.2±68.2*#473.6±56.9*759.2±38.4

2.2 各組B細胞、IgA、IgG、IgM及補體水平比較各組體液免疫指標IgA、IgG、IgM及補體C3、C4水平差異無統計學意義（P>0.05），重癥組、危重型組、普通型組患兒CD19+B細胞數低于對照組，其中重癥組、危重型組低于普通型組，差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組B細胞、IgA、IgG、IgM及補體水平比較Tab.2 Comparison of B cell，IgA，IgG，IgM and complement levels in each group ±s

表2 各組B細胞、IgA、IgG、IgM及補體水平比較Tab.2 Comparison of B cell，IgA，IgG，IgM and complement levels in each group ±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與普通型比較，#P<0.05

組別危重型組重型組普通型組對照組例數31 45 67 35 CD19+（個/mL）604.5±135.7*#755.4±132.4*#820.7±276.8*1 101.4±362.5 IgA（g/L）0.98±0.24 1.01±0.25 1.12±0.26 1.04±0.17 IgM（g/L）1.20±0.24 1.13±0.18 1.24±0.21 1.12±0.30 IgG（g/L）9.84±35.4 10.20±1.89 9.29±1.15 9.16±1.29 C3（g/L）0.97±0.11 0.94±0.15 1.02±0.16 0.99±0.12 C4（g/L）0.19±0.07 0.16±0.06 0.21±0.08 0.18±0.05

2.3 各組NK細胞及PRF、GrzB水平比較重癥組、危重型組、普通型組患兒NK細胞數低于對照組，其中重癥組、危重型組低于普通型組，PRF、GrzB反之，差異具有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 各組NK細胞及PRF、GrzB水平比較Tab.3 Comparison of NK cells，PRF and GrzB levels in each group ±s

表3 各組NK細胞及PRF、GrzB水平比較Tab.3 Comparison of NK cells，PRF and GrzB levels in each group ±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與普通型比較，#P<0.05

組別危重型組重型組普通型組對照組例數31 45 67 35 NK細胞（個/μL）376.4±71.5*#390.4±43.2*#422.8±86.9*609.3±105.4 PRF（%）87.2±7.64*#75.6±10.1*#70.5±13.4*55.3±12.7 GrzB（%）92.4±6.5*#83.9±7.0*#79.2±8.2*57.2±13.4

2.4 CD4+T細胞、PRF與PCIS評分、PRISMⅢ評分相關性分別評價重癥和危重癥患兒病情嚴重程度，其PCIS評分分別為（78.35±6.84）、（70.84±6.34）分，PRISMⅢ評分分別為（7.29±2.71）、（12.84±3.56）分。Pearson相關性分析顯示，CD4+T細胞與PCIS評分呈正相關（r=0.665，P<0.05），與PRISMⅢ評分呈負相關（r=-0.757，P<0.05），PRF與PCIS評分呈負相關（r=-0.615，P<0.05），與PRISMⅢ評分呈正相關（r=0.596，P<0.05），見表4。

2.5 CD4+T細胞、PRF表達與臨床預后預后良好患兒CD4+T細胞高于預后不良患兒，NK細胞PRF低于預后不良患兒，差異具有統計學意義（P<0.05），見表5。

表4 CD4+T細胞、PRF與PCIS評分、PRISMⅢ評分相關性Tab.4 The correlation between CD4+T cells，PRF and PCIS score，PRISMⅢscore

表5 不同預后患兒CD4+T細胞、PRF表達Tab.5 CD4+T cell and PRF expression in children with different prognosis ±s

表5 不同預后患兒CD4+T細胞、PRF表達Tab.5 CD4+T cell and PRF expression in children with different prognosis ±s

組別預后良好預后不良t值P值例數112 31 CD4+T（個/mL）1 126.7±163.8 652.3±142.7 14.6516<0.001 PRF（%）65.6±12.1 42.8±9.5 9.689<0.001

3 討論

HFMD是常見的兒童腸道病毒感染疾病，部分患兒病情發展嚴重可并發心肺衰竭、神經源性肺水腫等，引發患兒病死［9-10］。目前HFMD發病機制尚未明確，但已有多項研究證實細胞免疫在其中發揮作用。腸道病毒感染機體內，體內T細胞、B細胞、NK細胞等多種免疫細胞可迅速分化，從而釋放大量炎性因子或炎性介質，而過度活化的免疫應答損傷患兒肺部、大腦、神經等組織或臟器，對患兒預后產生不利影響［11］。

相關研究發現，在腸道病毒感染早期機體內可出現細胞免疫紊亂、分泌細胞因子大量增加、代償性抗炎反應強度增加，隨著病情持續發展，免疫細胞和炎癥介質逐漸消耗，患兒機體內免疫細胞數量開始減少，出現免疫抑制或免疫麻痹［12-13］。本次研究發現，HFMD患兒CD3+T、CD4+T、CD14+、CD19+B、NK細胞數及NK細胞PRF、GrzB均低于正常兒童，其中重癥、危重型患兒以上指標均低于普通型患兒，提示HFMD患兒體內存在明顯單核細胞、淋巴細胞數量的減少，且重型和危重型患兒減少更為明顯。而不同病情嚴重程度患兒IgA、IgG、IgM及補體C3、C4水平無顯著差異，提示隨病情進展，患兒體內出現明顯的細胞免疫功能抑制，因而可以說明細胞免疫異常也參與了HFMD的病情進展。CD4+T是機內常見免疫細胞，其絕對值與患兒年齡有關［14］，本次選擇各組患兒年齡無顯著差異，發現不同病情患兒體內CD4+T細胞數具有顯著差異，且重癥、危重癥患兒CD4+T細胞數目低于普通型患兒。一般來說，機體免疫細胞在病毒感染刺激下可迅速被激活，產生大量細胞因子來清除病毒［15］，而本次結果提示病情越重，CD4+T細胞表達抑制越嚴重。推測原因可能是在腸道病毒復制的過程中，能被CD4+T細胞識別的表型被重新修飾而引發CD4+T細胞受刺激和表達減少［16］。有學者認為，CD4+T細胞對主要腸道感染病毒EV71和CA16感染并不敏感，因而CD4+T細胞并未隨病情進展持續增加［17］。還有學者認為，病毒感染刺激后機體免疫系統可能出現偏倚，即CD4+T細胞作用降低的同時，機體其他免疫細胞（如NK細胞）對該病毒更為敏感，殺傷作用增強［18］，但本次研究中其他淋巴細胞也減少，故此結論有待進一步研究和論證。NK細胞作為機體免疫系統的第一道防線，也在腸道病毒感染過程中發揮重要作用［19］。NK細胞對病毒殺傷機制主要有兩點，一是調節T細胞表面抗原配體和Fas靶細胞表面抗原之間作用，二是細胞釋放PRF后可與靶細胞膜結合，PRF嵌入膜內形成中空多聚體，損傷胞膜完整，外界水分子、離子及其他小分子物質進入靶細胞內，影響細胞滲透壓從而破裂死亡［20-21］。PRF同時也協助顆粒酶通過顆粒胞吐作用進入靶細胞，并誘導細胞核caspases的非依賴性細胞死亡，因而PRF、GrzB表達升高有利于抗病毒作用［22］。而本研究中相對于重癥患兒，普通型患兒PRF、GrzB表達升高，提示其介導的細胞殺傷和細胞毒性作用也相應增加。推測原因可能是重癥患兒免疫功能不足，引發病毒大量復制和擴散，PRF、GrzB介導的細胞殺傷和細胞毒性作用增強，炎癥因子釋放引發組織損傷，從而進一步加重患兒病情［23］。相關性分析顯示，CD4+T細胞與PCIS評分呈正相關，與PRISMⅢ評分呈負相關，PRF反之，提示CD4+T細胞與PRF均與患兒病情嚴重程度密切相關。根據入院28 d是否死亡將患兒分為預后良好和預后不良，發現預后良好患兒CD4+T細胞高于預后不良患兒，NK細胞PRF低于預后不良患兒，提示CD4+T細胞與PRF能在一定程度上反映HFMD患兒預后。

綜上所述，手足口病患兒存在明顯CD4+T細胞表達過低、NK細胞PRF表達過高，兩者可用于重癥患兒細胞免疫狀況評估，且與患兒病情嚴重程度和預后不良有關。