壞死性凋亡機(jī)制及在結(jié)直腸腫瘤中的研究進(jìn)展

胡建生 王雯 劉海旺 張欣穎 孫林梅

1西安市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科（西安710016）；2西安交通大學(xué)護(hù)理系（西安710061）；3西安市第九醫(yī)院普外科（西安710054）

結(jié)直腸腫瘤是全球常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率排名第3位（10.2%），死亡率第2（9.2%），近十年發(fā)病率和死亡率不斷上升［1］，隨著社會的發(fā)展，預(yù)計到2035年全球結(jié)直腸腫瘤發(fā)病率將增加到250萬例［2］，而我國的結(jié)直腸腫瘤發(fā)病率居常見惡性腫瘤第3位（9.89%）［3］，結(jié)直腸腫瘤已然成為我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。目前治療結(jié)直腸腫瘤主要以手術(shù)、化療、放療為主，雖然診斷和治療等方面快速發(fā)展，但預(yù)后仍不容樂觀，主要原因之一是化療耐藥，在腫瘤患者中約80%～90%的死因歸結(jié)于直接或間接的耐藥性［4］，抑制細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和腫瘤干細(xì)胞等因素均可導(dǎo)致化療耐藥，目前針對腫瘤的耐藥性仍缺乏有效的改進(jìn)方案［5］。

凋亡是生物體內(nèi)普遍存在的一種細(xì)胞死亡方式，傳統(tǒng)化療藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤的生長［6］，然而腫瘤細(xì)胞往往由于自身凋亡機(jī)制失調(diào)而產(chǎn)生一定耐藥性。隨著對細(xì)胞死亡機(jī)制的深入研究，越來越多新的細(xì)胞死亡方式被不斷發(fā)現(xiàn)和報道，DEGTEREV A等［7］首次報道并命名了一種新型細(xì)胞死亡模式——壞死性凋亡（Necroptosis）。這是一種由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1/3（RIPK1/RIPK3）介導(dǎo)的磷酸化信號通路激活混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL/pMLKL）為特征的細(xì)胞死亡模式，與細(xì)胞凋亡有共同的途徑［8-9］。此種模式具有壞死樣細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特點，表現(xiàn)為溶酶體膜降解，細(xì)胞質(zhì)空泡化，質(zhì)膜解體，最終細(xì)胞爆炸樣破裂。目前研究已經(jīng)證實壞死性凋亡在包括IBD、動脈粥樣硬化，多種皮膚疾病、急性腎損傷和炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）在內(nèi)的多種炎癥性疾病中起重要作用［10-11］。最近研究認(rèn)為對細(xì)胞凋亡具有抗性的腫瘤細(xì)胞可能對壞死性凋亡途徑敏感［12-13］，提示研究腫瘤細(xì)胞壞死性凋亡及其調(diào)控機(jī)制有望成為結(jié)直腸腫瘤治療的靶點（表1）。

表1 壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子和其功能Tab.1 Key mediators in necroptosis and their function

1 壞死性凋亡的分子調(diào)節(jié)機(jī)制

程序性細(xì)胞死亡（即凋亡和壞死性凋亡）模式是由RIPK1通過其激酶功能驅(qū)動，包括通過形成復(fù)合物IIa導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和形成復(fù)合物IIb導(dǎo)致細(xì)胞壞死性凋亡。對壞死性凋亡分子機(jī)制的了解主要來自對TNFR1引發(fā)的信號通路的研究，腫瘤壞死因子（TNF?α）與TNFR相互作用后，TNFR1開始募集下游蛋白分子TNFR1相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域（TNFR1?associated death domain protein，TRADD、RIPK1、cIAPs（cellular inhibitor of apoptosis pro?teins）、TRAF2/5（TNFR?associated factor 2/5）和LU?BAC（linear ubiquitin chain assembly complex）蛋白形成復(fù)合體I，復(fù)合體I中RIPK1多聚泛素化并激活NF?κB（nuclear factor?κB）和MAPK（mitogen?acti?vatedprotein kinase）信號通路，抑制caspase?8的激活，使得細(xì)胞存活。

若TNF?α募集TRADD、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域FADD、pro?Caspase?8和RIPK1組成復(fù)合體IIa，復(fù)合體IIa促進(jìn)caspase 8的激活，激活的caspase 8通過激活Caspase 3而發(fā)生細(xì)胞凋亡［14-16］。當(dāng)caspase?8被抑制或其活性水平相對較低時，RIPK1募集RIPK3，兩者通過RHIM（RIP homotypic interaction motif）募集MLKL形成復(fù)合物IIb，又稱為壞死體（necrosome）［9］，MLKL的T357和S358位點磷酸化而激活，MLKL磷酸化會引起寡聚化和膜定位。寡聚化的MLKL具有與脂質(zhì)（心肌磷脂、磷酸肌醇）直接結(jié)合的能力，使得聚合的MLKL形成膜通透性孔道，細(xì)胞膜完整性被破壞，發(fā)生壞死性凋亡（圖1）［17-18，38］。有研究認(rèn)為［7，19］RIPK1在復(fù)合物Ⅰ中并無激酶活性，通過壞死性凋亡抑制劑（necro?statin?1）抑制RIPK1活性對TNF誘導(dǎo)的NF?κB信號通路并無影響，然而卻可阻止復(fù)合物IIb的形成來抑制壞死性凋亡，因此RIPK1在細(xì)胞中的作用可通過靶向藥物來決定細(xì)胞是存活還是發(fā)生壞死性凋亡。

2 壞死性凋亡與結(jié)直腸腫瘤的關(guān)系

2.1 壞死性凋亡雙向調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展壞死性凋亡在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著雙重作用。一方面壞死性凋亡可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。ZENG等［20］研究中分析了40例結(jié)直腸腺癌患者腫瘤樣本中RIPK1蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào)，而RIPK3和p?MLKL在結(jié)直腸癌中減少，認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中壞死性凋亡可能減少，凋亡可能增加。FENG等［21］研究發(fā)現(xiàn)RIPK3在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，RIPK3上調(diào)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而LIU等［22］研究小鼠炎性腸癌（CAC）模型中發(fā)現(xiàn)腫瘤中RIPK3呈高表達(dá)，并進(jìn)一步分析168個腫瘤和103個非腫瘤對照的結(jié)腸癌組織芯片，發(fā)現(xiàn)RIPK3在人類結(jié)直腸癌中高表達(dá)，而在刪除小鼠RIPK3基因后腫瘤數(shù)量和大小明顯減少，腫瘤負(fù)荷隨之減少，通過腸炎小鼠模型實驗證明RIPK3可能參與早期腫瘤的生長。基于上述研究結(jié)果，目前研究認(rèn)為壞死性凋亡是一把雙刃劍，RIPK3在結(jié)直腸癌組織中作用仍需多中心、前瞻性臨床對照實驗進(jìn)行證實。

2.2 壞死性凋亡在腫瘤治療的應(yīng)用壞死性凋亡已成為機(jī)體對病原體、炎癥和免疫的重要調(diào)節(jié)路徑，多種刺激可觸發(fā)細(xì)胞的壞死性凋亡［23］，一旦促凋亡分子不能刺激凋亡小體，就會觸發(fā)依賴于激酶活性RIPK1和RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡［24］。凋亡誘導(dǎo)劑在很大程度上與癌癥耐藥相關(guān)，通過非凋亡途徑殺死腫瘤細(xì)胞的藥物可以繞過傳統(tǒng)的耐藥，RIPK1和RIPK3是細(xì)胞死亡和存活途徑的關(guān)鍵分子［25］，是治療結(jié)直腸癌的潛在重要靶點。

圖1 壞死性凋亡在結(jié)直腸腫瘤中作用機(jī)制Fig.1 Molecular regulation mechanism of cell necroptosis in colorectal cancer

2.2.1 藥物靶向治療Nec?1（Necrostatin?1）是一種通過阻止RIPK1和RIPK3的相互作用的特異性壞死性凋亡抑制劑，可特異性抑制壞死性凋亡而不影響正常細(xì)胞功能和細(xì)胞凋亡，LIU等［26］通過結(jié)腸炎相關(guān)癌（CAC）鼠模型研究了Nec?1的抗腫瘤作用，認(rèn)為Nec?1可通過抑制JNK/c?Jun信號通路顯著抑制腫瘤的生長和發(fā)展，同時一批具有壞死性凋亡抑制活性的necrostatins相關(guān)化合物，包括Nec?3、Nec?4、Nec?5、Nec?7等也逐漸被深入研究。

細(xì)胞FLICE（FADD?like IL?1β?converting en?zyme）抑制蛋白（c?FLIP）是一種主要的抗凋亡蛋白，也是一種抑制細(xì)胞因子和化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子和化療耐藥因子。有研究稱c?FLIP在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平升高［27］，c?FLIP異構(gòu)體參與切換凋亡和壞死細(xì)胞死亡［28］，核糖體中的c?FLIP異構(gòu)體決定細(xì)胞的死亡是否發(fā)生RIPK3介導(dǎo)的壞性凋亡死或caspase依賴介導(dǎo)的凋亡。

篩選壞死性凋亡誘導(dǎo)物也是一種針對腫瘤細(xì)胞耐藥的新策略，HAN等［29］研究發(fā)現(xiàn)酯蟾毒配基（Resibufogenin）通過誘導(dǎo)RIPK3介導(dǎo)的激活糖原磷酸化酶（PYGL）、谷氨酰胺合成酶（GLUL）和谷氨酸脫氫酶（GLUDl）的活性來誘導(dǎo)CRC細(xì)胞壞死從而抑制腫瘤生長，說明RIPK3不僅是壞死細(xì)胞的分子開關(guān)，而且是控制細(xì)胞代謝狀態(tài)的樞紐［30-31］。HAN等［32］通過實驗證明紫草素對藥物敏感的癌細(xì)胞株（MCF?7和HEK293）及耐藥細(xì)胞系（過度表達(dá)P?糖蛋白、Bcl?2或Bcl?x L，這是臨床腫瘤耐藥的主要原因）表現(xiàn)出同樣的壞死性凋亡，證明紫草素等化合物可誘導(dǎo)耐藥癌細(xì)胞株壞死細(xì)胞死亡，從而抑制耐藥。DI等［33］研究FMRP蛋白（The Fragile X Mental Retardation Protein）與受體相互作用的蛋白激酶1（RIPK1）mRNA結(jié)合，提示FMRP通過監(jiān)測RIPK1 mRNA的代謝來調(diào)節(jié)壞死性凋亡通路。使用FMR1抗轉(zhuǎn)錄治療CRC細(xì)胞系會使RIPK1上調(diào)，使CRC細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。綜上可見，壞死性凋亡易感性是腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在弱點，因此發(fā)掘靶蛋白和壞死誘導(dǎo)物對結(jié)直腸腫瘤的臨床治療具有重要意義。

2.2.2 放療放射治療是治療癌癥的主要方法之一，超過50%的腫瘤患者在其疾病治療過程中接受了放療，其中40%可以通過放療治愈［34］，然而，腫瘤再發(fā)仍然是治療失敗的關(guān)鍵因素之一［35］。WANG等［36］首次研究表明，輻射誘發(fā)的壞死性凋亡是通過上調(diào)RIPK1和RIPK3的磷酸化，導(dǎo)致RIP1/RIP3/MLKL壞死體的形成。小劑量化學(xué)抑制劑或基因缺失對壞死性凋亡調(diào)節(jié)基因，特別是MLKL的阻斷可顯著抑制小鼠體內(nèi)外的腫瘤再發(fā)，甚至降低小鼠的致瘤性，檢測HT29和SW480細(xì)胞來源的結(jié)直腸癌細(xì)胞在照射后IL?8增加，提出了一個新的途徑——RIP1/RIP3/MLKL/JNK/IL?8參與壞死細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤再增殖，MLKL/JNK/IL?8可能成為阻斷腫瘤再聚和提高放療療效的潛在靶點。上述研究提示針對壞死性凋亡的放療方案可能成為提高放療效果的有效方式。

2.2.3 其他治療一些復(fù)合物被證實可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，但仍局限與基礎(chǔ)研究。FANG等［37］研究通過以Survivin?XIAP復(fù)合物為靶點的多肽Su?X來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的壞死性凋亡，經(jīng)過Su?X處理的細(xì)胞中壞死性凋亡相關(guān)蛋白（p?RIP1、p?RIP3、p?MLKL）均顯著升高，提示Su?X可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的壞死性凋亡來抑制腫瘤的發(fā)展。從腫瘤治療的角度來看，進(jìn)一步加大研究力度以尋求更有效和個體化的治療極其重要，以往單藥治療腫瘤效果的局限性使得研究和發(fā)展聯(lián)合療法迫在眉睫。

3 小結(jié)

細(xì)胞壞死性凋亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的程序性死亡方式，與多種病例生理過程密切相關(guān)，目前壞死性凋亡相關(guān)研究多處于基礎(chǔ)實驗階段。壞死性凋亡在抗腫瘤方面發(fā)揮對立作用，一方面可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移；另一方面能夠發(fā)揮促腫瘤生長的作用，參與腫瘤早期形成。進(jìn)一步深入研究壞死性凋亡通路的分子機(jī)制以及相關(guān)信號通路上下游信號分子的關(guān)系，探明其在結(jié)直腸腫瘤在不同模式中的作用，尋找相應(yīng)的靶向藥物，是未來提高結(jié)直腸腫瘤治療效果的方向之一。