梅毒血清固定患者NLRP3炎癥小體及細胞因子表達的研究

魯東平 張榮 王芬 魏少鳳 賈婕 張偉蓮 劉婷 梁瑞 楊文志

1深圳市寶安中醫院（集團）（廣東深圳518133）；2深圳市寶安區慢性病防治院皮膚科（廣東深圳518133）；3鄂東醫療集團黃石市婦幼保健院產科（湖北黃石435000）；4深圳市寶安區中心醫院（廣東深圳518102）

梅毒血清固定是早期梅毒治療后血清學結果長期保持陽性的一種特殊狀態，隨著梅毒發病率增長迅速，診斷為梅毒血清固定的病例也有明顯增加［1］，梅毒血清固定患者體內有沒有梅毒螺旋體（Tp）存在？有沒有必要反復治療？諸多疑惑困擾著患者，他們的身心健康及家庭關系受到影響［2］。在臨床隨訪工作中這種現象比較普遍，但是目前關于該病的成因還不清楚。

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體是細胞內的一個多蛋白復合物，由NLRP3、凋亡相關點樣蛋白（ASC）和前體胱天蛋白酶?1（Pro?caspase?1）組成，是天然免疫中重要的模式識別受體，通過信號傳導，激活炎癥因子；一旦該信號通路被激活，會誘導IL?1β和IL?18的分泌和成熟，它們會在感知細菌、螺旋體等的感染的天然免疫中，以及在宿主對感染而產生的獲得性免疫反應中起著重要作用［3-4］。已有報道證實在兔模型中NLRP3炎癥小體參與了梅毒感染引起的炎癥過程［5］，但是它們是否與梅毒血清固的形成相關尚未見報道，本實驗采用實時熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測梅毒血清固定患者及健康人的外周血單核細胞NLRP3炎癥小體的表達，探討NLRP3信號通路相關因子在梅毒血清固定患者中的作用，從天然免疫方向來研究梅毒血清固定可能的發病機制，為該病的防治提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象與分組病例的選擇：選取2018年9月至2020年9月在我院就診時已確診為梅毒血清固定患者50例作為實驗組，其中男26例，女24例，年齡22～40歲，平均（26.3±4.2）歲；納入標準：（1）配偶或患者有不潔性交史；（2）每例病人均已接受過規范的梅毒治療方案驅梅治療，無臨床癥狀或治療后臨床癥狀消失；（3）3年隨訪期間經TRUST、TPPA檢測均陽性，第一年每3個月有復查1次，第二年每6月復查血清1次，第三年復查血清1次；在隨訪期間滴度無下降或上升4倍的情況，TRUST滴度均≤1∶8；（4）HIV抗體檢測陰性；無生物學假陽性；（5）配偶或性伴長期性接觸未被傳染，育齡女性分娩的嬰兒未被傳染。實驗組所有研究對象同時滿足以上5個條件［6］。

健康對照組的選擇：根據兩組年齡和性別構成選健康志愿者50例作為對照組，其中男24例，女26例，年齡24～41歲，平均（25.8±4.1）歲；納入標準：（1）HIV抗體檢測陰性；（2）血清學TRUST連續兩次（間隔1月復查）檢查陰性。對照組所有研究對象同時滿足以上2個條件。兩組性別、年齡分布差異無統計學意義（P>0.05）。本研究符合醫院倫理委員會要求。

排除標準：排除患有2型糖尿病、肥胖、痛風、矽病、阿爾茨海默病及克羅恩病等已知的可以影響NLRP3炎癥小體信號通路的疾病；排除各種急慢性感染性疾病、嚴重的肺部疾病、肝臟及腎臟疾病。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集采集來我院就診的梅毒血清固定患者（50例）及健康志愿者（50例）的外周血。采集前，進行常規消毒采集點及周圍皮膚，經肘部靜脈采集外周靜脈血8 mL，共分二管，迅速置于肝素化的抗凝管中。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT?PCR）采用Ficoll?Hypaque淋巴細胞分離液密度梯度離心法，分離各樣本PBMCs；采用Trizol（大連TaKaRa公司）法提取PBMCs中的mRNA；用BioMate 3S分光光度計測量260 nm和280 nm波長處理的OD值檢測mRNA純度、含量及完整性；使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（大連TaKaRa公司）進行qRT?PCR。簡要步驟為先去除基因組DNA；隨后立即進行逆轉錄，體系如下：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃保存；最后于Bio?熒光定量PCR儀（美國伯樂BIO?RAD公司）進行Real Time PCR擴增；擴增條件：預變性95℃，30 s；PCR反應40個循環，變性95℃，5 s；復性延伸60℃，30～60 s；PCR各基因所用引物引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成序列如表1；結果目的基因的表達水平通過GAPDH（glyceraldehyde?3?phosphate de?hydrogenase）進行歸一化處理，采用2?ΔΔCt法對目的基因進行相對定量。

表1 qRT?PCR所用引物Tab.1 Primers used for qRT?PCR in this study

1.2.3 ELISA測定血清IL?1β和IL?18的含量取抗凝血4 mL，迅速室溫1 000×g離心30 min收集樣本，小心取上清，分裝后-20℃儲存。采用Hu?man IL?1β High Sensitivity ELISA Kit（人白介素1β高敏ELISA試劑盒）和Human IL?18 ELISA Kit（人白介素18 ELISA試劑盒）購自杭州聯科生物技術股份有限公司，測定IL?1β和IL?18的含量，步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.2.4 統計學方法利用GraphPad Prism 8統計學軟件進行統計分析，各項檢測結果均采用均值±標準誤表示。基因相對表達量及細胞因子水平的組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以α=0.05為檢驗標準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 梅毒血清固定患者PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達統計學結果顯示，梅毒血清固定組PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達均低于健康組，差異均有統計學意義（P<0.05，圖1），mRNA具體的相對表達量見表2。

圖1 梅毒血清固定患者PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達水平Fig.1 Expression of NLRP3，ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs of patients with syphilis serofast state

表2 PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的相對表達量Tab.2 The relative expression of NLRP3，ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs ±s

表2 PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的相對表達量Tab.2 The relative expression of NLRP3，ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs ±s

Group Health Serofast state t值P值Case 50 50/ /NLRP3 mRNA 1.18±0.19 0.99±0.15 5.53<0.001 ASC mRNA 1.07±0.19 0.89±0.17 5.02<0.001 Caspase?1 mRNA 1.08±0.18 0.90±0.18 4.96<0.001

2.2 梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的表達統計學分析顯示，梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β及IL?18mRNA的表達水平均較健康者低，差異均有統計學意義（P<0.05，圖2），mRNA具體的相對表達量見表3。

圖2 梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β和IL?18 mRNA的表達水平Fig.2 Expression of（A）IL?1β and（B）IL?18 mRNA in PBMCs of patients with syphilis Serofast state

2.3 梅毒血清固定患者血清中的IL?1β和IL?18含量統計學結果顯示，梅毒血清固定患者血清 中IL?1β和IL?18的含量均低于健康者，差異均有統計學意義（P<0.05，圖3），具體表達量見表4。

表3 PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的相對表達量Tab.3 The relative expression of IL?1β and IL?18 mRNA in PBMCs±s

表3 PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的相對表達量Tab.3 The relative expression of IL?1β and IL?18 mRNA in PBMCs±s

GroupCaseIL?1β mRNAIL?18 mRNA Health500.91±0.160.88±0.15 Serofast state t值P值50/ /0.66±0.10 9.24<0.001 0.56±0.11 11.87<0.001

圖3 梅毒血清固定患者血清中IL?1β和IL?18的水平Fig.3 IL?1 β and IL?18 in serum of patients with syphilis serofast state

表4 血清中IL?1β及IL?18水平的差異Tab.4 Difference of IL?1β and IL?18 levels in serum±s

表4 血清中IL?1β及IL?18水平的差異Tab.4 Difference of IL?1β and IL?18 levels in serum±s

GroupCaseIL?1β（pg/mL）IL?18（pg/mL）Health images/BZ_84_1404_2704_1566_2755.png3.55±0.90249.58±22.26 Serofast state502.98±0.87193.75±14.82 t值/3.2514.76 P值 /0.0016<0.001

3 討論

早期梅毒患者確診后經規范用驅梅治療，絕大部分患者的臨床癥狀完全消失，達到臨床治愈，但有部分患者治療后梅毒血清學試驗在很長時間內不會轉陰，表現為梅毒血清固定，已有報道其發生率約為15%～44.4%［7-8］。在臨床隨訪過程中這樣的患者有很多，目前其發病機制尚不清楚，讓醫患都感到困惑。該病的相關研究主要在獲得性免疫方面，關楊等［9-10］認為梅毒血清固定患者存在嚴重的細胞免疫失衡和免疫抑制，從而使少量的TP逃脫機體免疫系統的捕獲，導致慢性感染；周平玉［11］則認為：梅毒血清固定可能是機體的一種特殊的免疫狀態而非TP的持續存在。為了弄清楚其成因，近來國內外的學者對天然免疫在梅毒血清固定形成中的作用開展了一些研究，并認為天然免疫在其中也有重要的作用［12-14］。NLRs家族的NLRP3炎癥小體在調節天然和獲得性免疫反應時，因其具有參與免疫和抗微生物等重要作用而備受關注［15］。已有研究表明NLRP3炎癥小體在梅毒感染免疫中發揮了重要作用［15］，但目前國內外文獻中未見關于NLRP3炎癥小體與梅毒血清固定的形成關系的報道。本研究采用病例對照研究的方法，通過qRT?PCR檢測梅毒血清固定患者和健康者PBMCs中NLRP3炎癥小體及細胞因子，探究NLRP3炎癥小體與梅毒血清固定的形成關系。

NLRP3炎性小體是NLRs家族成員中被研究最多的受體，它是一種存在于細胞質中的蛋白復合物，由NLRP3、ASC和Pro?caspase?1組成；ASC是NLRP3炎性小體的重要的接頭蛋白，連接上游的NLRP3和下游的Pro?caspase?1，caspase?1是NLRP3炎性小體的效應蛋白，是調節炎癥反應以及細胞凋亡的一類蛋白酶家族［16］。正常情況下，它以無活性的前體形式存在，其激活依賴于炎性復合體被外源入侵微生物或者由組織損傷產生的內源性危險信號，激活后將無活性Pro?caspase?1轉變成有活性的caspase?1，進而能將無活性的促炎細胞因子IL?1β和IL?18的前體剪切加工為成熟的IL?1β和IL?18［17］；這兩個細胞因子均屬于IL1家族成員，具有多樣生物學活性，是Th1細胞生長和分化因子；可以誘導活化B細胞、T細胞和NK細胞產生IFN?γ；還可以通過上調Fasl表達來促進NK細胞毒性；它們作為促炎癥細胞因子而參與炎癥反應，參與機體的抗感染免疫，及時有效地清除病原體［18-20］。本實驗結果顯示梅毒血清固定患者PBMCs中的NLRP3、ASC及Caspase?1mRNA表達明顯低于健康者（P<0.05），提示梅毒血清固定患者體內參與天然免疫的NLRP3信號通路存在異常，且該信號通路下游的IL?1β和IL?18的表達和分泌也均低于健康者（P<0.05），推測此類患者體內IL?1β和IL?18的下調可能會導致NK細胞、Th1型細胞因子、T細胞減少或表達失衡，導致機體的免疫功能抑制，在梅毒感染免疫的過程中機體對Tp的免疫清除能力降低，形成梅毒血清固定現象。相關研究顯示梅毒血清固定患者外周血中NK細胞顯著降低，NK細胞數量降低可能是導致該現象形成的重要原因［21］。國內外已有的研究表明梅毒血清固定患者存在外周血Th1型細胞因子、Th17和CD4+T細胞減少，會導致Th1/Th2型細胞因子的失衡、Treg/Th17和CD4+T/CD8+T細胞免疫失衡，致使機體的梅毒感染免疫應答受到抑制，小部分Tp逃過機體的細胞免疫，未能被及時徹底清除，形成梅毒血清固定［10，22-23］。說明NLRP3炎癥小體及下游細胞因子可能在抗Tp感染免疫的過程中，對正常啟動獲得性免疫起到了關鍵性調控作用，并參與了梅毒血清固定的形成。

綜上所述，筆者認為梅毒血清固定患者存在天然免疫異常，其體內的NLRP3炎癥小體表達下調可能會影響到信號通路的下游細胞因子和相關細胞參與的梅毒感染免疫反應，導致梅毒血清固定形成。但具體免疫網絡及其相關細胞因子間互相調節的分子機制并不是十分清晰，后續還需就其具體的分子機制進行深入的研究。