氯喹通過阻斷腫瘤壞死因子受體相關因子3自噬性降解抑制類風濕關節炎滑膜細胞活化

呂昌偉 和晶 張乾 郗海濤 強毅 張靜濤

西北大學附屬醫院/西安市第三醫院骨科（西安710018）

類風濕性關節炎是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，最終可導致骨關節損傷甚至殘疾［1］。類風濕性關節炎病理改變以慢性滑膜炎和骨關節結構損害為特征，其發病機制尚未明確，目前并無完全有效的根治方法［2］。近來的研究顯示，纖維樣滑膜細胞（fibroblast?like synoviocyte，FLS）的異常活化在類風濕性關節炎的發展中發揮了關鍵作用，其可通過產生炎性因子引起滑膜炎癥和病理損傷［3］。活化的FLS表現出過度增殖，并產生多種炎癥因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），如TNF?α、IL?1β、IL?6、CXCL10、MMP?2和MMP?9，造成關節的慢性炎癥和持續性破壞［4］。腫瘤壞死因子受體相關因子3（TNF receptor associated factor 3，TRAF3）是屬于腫瘤壞死因子受體作用因子超家族成員，是細胞內一種重要的負性調控蛋白，包括抑制CREB、NF?κB和STAT3信號［5］。NF?κB信號的異常激活可引起持續高強度炎癥，導致IL?6、MMP?2、MMP?9、CXCL10等多種炎性因子水平升高，誘發多種自身免疫性疾病［6］，并在FLS的激活中發揮了重要作用［4］。

目前，氯喹用于類風濕性關節炎治療取得了較好的療效，但其作用機制尚不明確。本研究探討氯喹對FLS異常激活的抑制作用，并通過探討氯喹對TRAF3蛋白水平的影響，以及對TRAF3自噬性降解的影響，以期闡明氯喹抑制FLS活化的分子機制，為氯喹治療類風濕性關節炎的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與處理類風濕關節炎滑膜細胞（MH7A）于重慶巴而思生物科技有限公司購買，采用RPMI?1640培養基（Gibco，美國）補充10%胎牛血清（AusGeneX，澳大利亞）和1%青鏈霉素（碧云天，中國）進行培養。采用TNF?α預處理建立類風濕關節炎滑膜細胞活化模型，即除對照組外，所有MH7A細胞接受5 ng/mL的重組人THF?α（BBI，中國）預刺激24 h。根據實驗，分別采用20 μmol/L氯喹（MCE，美國）、10 μmol/L雷帕霉素（Rapa，MCE）和10 μmol/L蛋白酶體抑制劑MG?132（MCE）處理細胞24 h。siRNA干擾TRAF3表達細胞，進行siRNA轉染后，進行上述藥物處理。

1.2 si?RNA轉染使用不含青霉素/鏈霉素的RPMI?1640培養基接種細胞至6孔板，培養12 h。將TRAF3 siRNA（Santa Cruz，美國）溶于optiMEM培養基（Gibco），將相應體積lipofectamin 2000（In?vitrogen，美國）溶于optiMEM培養基中，將配制好的siRNA溶液和lipofectamin 2000溶液等體積混合，室溫穩定20 min，加入4倍體積新鮮optiMEM培養基混勻。吸出細胞舊培養基，每孔加入1 mL配制好的siRNA轉染液，細胞培養箱中孵育5 h，換為正常培養基，繼續培養24 h后用于后續實驗。

1.3 細胞增殖檢測細胞處理結束后，采用CCK?8試劑（碧云天）檢測細胞增殖。吸出舊培養接，使用新培養基配制CCK?8溶液，加入各處理孔，37℃培養箱放置1 h，使用酶標儀（TECAN，瑞士）在450 nm測定吸光度。

1.4 Real?time PCR細胞處理結束后，RNAiso Plus（TaKaRa，中國）按照使用說明書提取總RNA，采用PrimeScriptRT Master Mix試劑盒（TaKaRa）按照說明書逆轉錄為cDNA。采用TB Green Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa）按照使用說明，進行real?time PCR檢測。引物序列如下：GAPDH：forward 5′?AGGTCGGTGTGAACGGATT?3′，reverse 5′?AAT CTCCACTTTGCCACTGC?3′；TRAF3：forward 5′?AC?ATCCGCCTAGCCGACATGG?3′，reverse 5′?CTGCT?TCCGCCGCTTGTAGTC?3′。

1.5 ELISA檢測細胞處理結束后，收集細胞培養上清，采用ELISA試劑盒檢測細胞培養上清中促炎因子含量。IL?6和CXCL10 ELISA檢測試劑盒訂購于博士德生物，按照產品說明書進行操作。

1.6 Western blot細胞處理結束后，RIPA裂解液（碧云天，中國）提取蛋白，BCA蛋白測定試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度，加入4×Laemmli上樣緩沖液（Bio?Rad，美國），97.5℃變性10 min。SDS?PAGE凝膠電泳，轉模后5%脫脂奶粉室溫封閉，洗膜后分別孵TRAF3一抗（1∶1 000，CST，美國）、LC3一抗（1∶1 000，CST）、MMP?2一抗（1∶1 000，Protein?tech）、MMP?9一抗（1∶1 000，Proteintech），β?actin一抗（1∶2 000，CST），4℃過夜。洗膜后羊抗鼠和羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）室溫孵育1 h，化學發光，ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統（Bio?Rad）中曝光檢測。

1.7 統計學方法結果數據采用（）表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。兩組數據之間的比較采用t檢驗，多組數據之間的比較采用單因素方差分析并跟以Fisher′s post hoc檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯喹抑制類風濕關節炎滑膜細胞活化相比對照組，TNF?α刺激導致了MH7A細胞IL?6和CX?CL10分泌顯著增加（圖1B、C），并且引起了MH7A細胞侵襲蛋白MMP?2和MMP?9表達增加（圖1D），表明TNF?α預刺激有效引起了MH7A細胞活化。與TNF組相比，氯喹處理顯著抑制了MH7A細胞增殖（圖1A），降低了TNF?α引起的IL?6和CXCL10分泌（圖1B、C），以及MMP?2和MMP?9表達（圖1D）。這些結果表明，氯喹可顯著抑制類風濕關節炎滑膜細胞活化。

圖1 氯喹抑制MH7A纖維樣滑膜細胞活化Fig.1 Chloroquine inhibits the activation of MH7A fibroblast?like synoviocytes

2.2 氯喹引起MH7A細胞TRAF3蛋白含量升高TNF?α刺激和氯喹處理均未引起MH7A細胞TRAF3 mRNA表達的變化（圖2A），表明氯喹并不引起TRAF3基因表達水平的改變。然而，Western blot結果顯示。氯喹處理可導致MH7A細胞內TRAF3蛋白含量顯著升高（圖2B）。這些結果提示，氯喹所致的TRAF3蛋白水平升高，并不是源于其基因表達的上調，而可能源于氯喹抑制了TRAF3的降解。

圖2 氯喹引起MH7A滑膜細胞TRAF3蛋白表達升高Fig.2 Chloroquine increased the expression of TRAF3 protein in MH7A synoviocytes

2.3 TRAF3介導了氯喹對MH7A細胞活化的抑制通過TRAF3 siRNA下調MH7A細胞TRAF3蛋白表達，探討TRAF3在氯喹抑制MH7A細胞活化中的作用。結果顯示，si?TRAF3顯著降低了MH7A細胞內TRAF3蛋白水平（圖3A）。由結果可見，si?TRAF3可顯著拮抗氯喹對MH7A細胞活化的抑制作用，阻斷了氯喹對IL?6和CXCL10的分泌抑制（圖3B、C），并解除了氯喹對MMP?2和MMP?9蛋白表達的抑制（圖3D）。

2.4 氯喹抑制了TRAF3蛋白的自噬性降解進一步實驗可見，氯喹可引起MH7A細胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值降低（圖4A），表明氯喹抑制了MH7A細胞自噬。自噬誘導劑雷帕霉素（RA）則顯著增加了細胞自噬水平（圖4A）。并且，雷帕霉素拮抗了氯喹的效應，導致MH7A細胞TRAF3蛋白水平明顯降低（圖4B）。此外，氯喹所致的TRAF3蛋白含量升高未被蛋白酶體抑制劑MG132進一步增強（圖4B）。這些結果表明，氯喹可能主要通過抑制細胞自噬，阻斷TRAF3的自噬性降解，導致了MH7A細胞TRAF3蛋白含量升高。

圖3 TRAF3介導了氯喹對MH7A細胞的活化抑制Fig.3 TRAF3 mediated the inhibition of the activation of MH7A cells by chloroquine

圖4 氯喹抑制MH7A細胞自噬和TRAF3蛋白自噬性降解Fig.4 Chloroquine inhibits autophagy of MH7A cells and autophagic degradation of TRAF3 protein

2.5 誘導自噬可拮抗氯喹對MH7A細胞的活化抑制采用自噬誘導劑雷帕霉素和氯喹共處理MH7A細胞。可見，與氯喹處理組相比，雷帕霉素可對抗氯喹作用，顯著促進MH7A細胞IL?6和CX?CL10分泌增加（圖5A，B），并引起MH7A細胞MMP?2和MMP?9蛋白水平升高（圖5C）。這些結果進一步證實了氯喹通過阻止TRAF3自噬性降解抑制MH7A細胞活化。

圖5 誘導自噬可拮抗氯喹對MH7A細胞的活化抑制Fig.5 Induction of autophagy antagonized the inhibition of MH7A cell activation by chloroquine

3 討論

類風濕性關節炎的病理機制至今尚未明確，使得其缺乏確切有效的根治方法。近來，纖維樣滑膜細胞（FLS）的異常活化在類風濕性關節炎的發病機理中獲得了重視。FLS在類風濕性關節炎的多種病理進程中均發揮了關鍵作用，如滑膜炎癥，血管翳生長，以及最終的軟骨和骨破壞［7］。FLS在炎性滑膜的異常增生是類風濕性關節炎的典型特征［7］。這種細胞的增多源于FLS的大量增殖和凋亡減少［8］。另外，FLS被激活后可分泌基質金屬蛋白酶，使細胞表現出侵襲特性，并導致關節組織破壞［7，9］。在類風濕性關節炎的滑膜炎癥中，FLS激活同樣發揮了重要作用。活化的FLS可分泌多種促炎因子，如IL?6、IL?1β和CXCL10等［10-11］，進而影響其他細胞和自身免疫反應性。本研究中，采用TNF?α預刺激建立FLS活化模型。結果可見，TNF?α預刺激可引起FLS細胞增殖，導致MMP?2和MMP?9蛋白表達升高，并引起IL?6和CXCL10分泌的增加，表明TNF?α刺激有效引起了FLS細胞的活化。

氯喹和羥氯喹已被應用于治療輕中度類風濕性關節炎，以及重度類風濕性關節炎治療時的聯合用藥［12］。雖然氯喹對免疫?炎癥反應的抑制作用已被發現和報道，包括抑制免疫細胞增殖和活性，抑制炎癥因子分泌，但對其治療類風濕性關節炎的藥理機制了解仍非常有限［13］。在本實驗研究發現，氯喹處理可有效抑制FLS細胞的增殖、炎癥因子分泌以及侵襲標志物MMP?2和MMP?9的表達，表明氯喹可有效抑制FLS的異常活化。這些結果表明，抑制FLS異常激活可能是氯喹治療類風濕性關節炎的重要機制。同時，氯喹是一種高效的親溶酶體抑制劑，可特異的抑制細胞溶酶體自噬途徑［14］。自噬從多個方面參與了類風濕性關節炎的病理進程，包括FLS的存活、侵襲和凋亡抵抗［15］。最新的研究顯示，抑制自噬可以提高類風濕性關節炎的治療效果［16］。因此，氯喹可能通過抑制溶酶體自噬而發揮上述FLS活化抑制作用。本研究證實，氯喹處理可顯著抑制FLS細胞自噬，表現為LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值的降低。

TRAF3是一種重要的炎癥?免疫負性調控因子，其通過抑制多種信號通路而抑制免疫細胞活化，如NF?κB、IL?6R、CD40和CREB信號通路［5，17］。已有研究顯示，激活TRAF3信號可以抑制肝癌細胞的增殖和侵襲，并可減輕動物炎癥反應［18-19］。本研究發現，氯喹能夠增加MH7A細胞內TRAF3的蛋白含量，而干擾TRAF3表達阻斷了氯喹對MH7A細胞活化的抑制，表明氯喹通過TRAF3增加抑制FLS活化。進一步研究發現，并且這種增加不是由于基因表達的增加。因此，氯喹可能通過抑制溶酶體自噬降解而實現TRAF3的蛋白含量升高。這一猜測被自噬誘導劑和蛋白酶體抑制劑實驗證實。這些結果表明，氯喹通過阻斷TRAF3溶酶體自噬降解，抑制FLS細胞活化。

NF?κB信號激活和類風濕性關節炎的滑膜病變程度程正相關，抑制NF?κB表達和信號激活，可顯著抑制類風濕性關節炎的病情進展［20］，而增加NF?κB表達可加速類風濕性關節炎的侵襲進展［21］。NF?κB是TRAF3的主要負性調控信號通路，因此TRAF3對纖維樣滑膜細胞活化的抑制可能藉由抑制NF?κB信號實現。

本研究從類風濕性關節炎纖維樣滑膜細胞異常活化角度，闡明了氯喹治療類風濕性關節炎的藥理機制。氯喹長時間大劑量的類風濕性關節炎治療應用可誘發不良反應，尤其是眼毒性［22］。因此，闡明氯喹治療類風濕性關節炎的藥理機制，有助于指導臨床聯合用藥，降低藥物劑量，有利于降低不良反應的發生。