糖蛋白絲甘蛋白聚糖促進卵巢癌細胞的化療耐藥和轉移

鄧曉芳 彭俊琴 陳歷排 盧斌貴

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院1內科二區，2醫學影像科，3婦瘤科（廣州510095）

卵巢癌是繼宮頸癌及子宮內膜癌之后發生率居第三位的婦科惡性腫瘤，其死亡率一直居女性生殖道惡性腫瘤的首位［1］。早期卵巢癌經手術及化療后，其5年生存率達80%～95%，而中晚期卵巢癌僅為20%～30%。癌細胞減滅術聯合化療是目前中晚期卵巢癌的標準治療方案。盡管治療手段不斷發展，但中晚期卵巢癌患者的預后和死亡率仍未得到明顯改善，原因在于化療耐藥和轉移［2］。

糖蛋白絲甘蛋白聚糖（Serglycin）是一種小分子蛋白多糖，在造血細胞和內皮細胞中最早發現，參與炎癥介質的儲存和分泌［3-4］。最近有報道指出Serglycin參與多種腫瘤細胞的耐藥和轉移［5-6］，但Serglycin在卵巢癌中的作用鮮有報道。本研究擬在人卵巢癌SKOV3細胞株中，通過構建穩定干擾Serglycin低表達的細胞株，探究Serglycin與卵巢癌耐藥及轉移的關系，為闡明卵巢癌耐藥及轉移的分子機制和改善晚期卵巢癌的臨床治療效果提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細胞系SKOV3購于美國ATCC。培養基為RPMI?1640，含10%胎牛血清，將細胞置于5%CO2、95%飽和濕度的培養箱中培養。取對數期的細胞進行實驗。Serglycin基因的shRNA干擾慢病毒購于上海吉凱基因。cDNA逆轉錄試劑盒及實時定量PCR試劑購于美國Fermentas公司。由華大基因合成引物。Serglycin、β?actin抗體購于美國Santa Cruz。Ecadherin、ZEB1/2抗體購于美國Cell Signal?ling公司。ECL化學發光檢測試劑盒購于美國Pierce公司。順鉑（cDDP）購置美國Sigma公司。Transwell小室購置美國Corning公司。

1.2 構建敲低Serglycin穩定細胞系利用shRNA干擾技術，構建穩定敲低Serglycin基因的兩株細胞系：SKOV3/shSerglycin1#和SKOV3/shSerglycin2#，及對照細胞株：SKOV3/shCon。具體為接種適量SKOV3細胞于24孔板中，待細胞生長達60%～80%時將1 mL的shSerglycin1#、shSerglycin2#慢病毒液和陰性對照的shCon分別加入24孔板中的SKOV3細胞中，置于培養箱中感染48 h，后將細胞轉至6孔板，并用2 μg/μL的嘌呤霉素篩選穩定細胞株。

1.3 實時定量PCR檢測Serglycin的表達取對數生長期的SKOV3/shSerglycin1#、SKOV3/shSergly?cin2#和空白對照組SKOV3/shCon細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參，進行實時定量PCR，所有實驗獨立重復3次。Sergly?cin的引物序列是：FP：5′?TCCAACAAGATCCCCC?GTCT?3′，RF：5′?TTCCGTTAGGAAGCCACTCC?3′。

1.4 蛋白質免疫印跡（Western blot）用RIPA裂解液裂解上皮卵巢癌細胞，BCA法檢測蛋白含量，于100℃蛋白變性。用10%SDS?PAGE膠進行蛋白垂直電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃搖床孵育抗體過夜，TBST溶液洗膜3次，用HPR標記二抗，然后在室溫下孵育條帶1 h，在暗室內用ECL發光試劑顯影。

1.5 卵巢癌細胞SKOV3藥物敏感性檢測取3×103個細胞接種于96孔板中，24 h后依次加入梯度濃度（0、3、6、9、12、15 μmol/L）的含化療藥物順鉑（cDDP）的RPMI?1640培養基。化療作用48 h后，每孔加入20 μL MTS試劑，37℃繼續孵育2.5 h，酶標儀測定OD值。計算各組細胞的存活率，繪制細胞生長曲線圖。

1.6 體外腫瘤細胞侵襲實驗用無血清的培養基制備1×105個/mL的細胞懸液，吸取0.5 mL的細胞懸液于鋪膠Transwell小室內，置于恒溫箱中孵育36 h，然后吸掉小室里的液體，小心擦拭掉上室面的細胞，用PBS洗滌3次，用甲醇固定遷移到膜下室面的細胞30 min，然后用1%結晶紫染色10 min，漂洗，晾干后在顯微鏡下觀察遷移后的細胞數量并拍照記錄結果。

1.7 生物信息學分析利用TCGA數據庫（http：//gepia.cancer?pku.cn/index.html）和在線預后分析軟件（http：//kmplot.com），分析Serglycin在卵巢癌中的表達及與卵巢癌患者的預后關系。

1.8 統計學方法采用Prism 5.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 敲低Serglycin增強卵巢癌細胞SKOV3的化療敏感性qRT?PCR及Western blot結果顯示：shSerglycin1#和shSerglycin2# mRNA和蛋白質相對表達量均低于對照組，而shSerglycin1# mRNA和蛋白質相對表達量均低于shSerglycin2#（圖1A、B）；MTS法檢測結果顯示：相對于對照組，不同梯度濃度化療藥物處理的shSerglycin1#卵巢癌細胞存活率均低于對照組（圖1C），表明敲低Serglycin可增強卵巢癌細胞的化療敏感性。

圖1 敲低Serglycin與shCont卵巢癌細胞的化療敏感性比較Fig.1 Chemotherapy sensitivity of Serglycin knockdown versus control ovarian cancer cells

2.2 敲低Serglycin抑制卵巢癌細胞的侵襲轉移Transwell小室實驗結果發現，敲低Serglycin基因的SKOV3細胞穿過基質膠的細胞數為（42±4.3）個/視野，而對照組的穿過基質膠細胞數是（141.3±5.6）個/視野（圖2A）。與對照組相比，敲低組的穿膜細胞數明顯減少，差異均具有統計學意義（P<0.01），表明Serglycin可明顯促進卵巢癌SKOV3細胞的侵襲、轉移（圖2B）。

圖2 敲低Serglycin卵巢癌細胞與shCont侵襲轉移力的比較Fig.2 Knock down Serglycin inhibit invasion and metastasis of ovarian cancer cells

2.3 Serglycin促進卵巢癌細胞的EMT的改變Western blot檢測顯示，相對于對照組shCont，shSer?glycin1#SKOV3細胞系間質細胞標志物Vimentin蛋白表達降低，而上皮細胞標志物Ncadherin蛋白表達升高，同時EMT相關轉錄因子ZEB2表達明顯降低（圖3A）。TCGA數據庫分析發現在卵巢癌組織標本中Serglycin表達與CDH2（編碼Ncadherin蛋白）表達呈負相關（r=-0.099，P=0.041），與VIM表達（編碼Vimentin蛋白）呈正相關（r=0.19，P<0.001），而且與ZEB2表達呈正相關（r=0.6，P<0.001，圖3B）。

圖3 Serglycin干擾后卵巢癌細胞的EMT的改變Fig.3 EMT changes in ovarian cancer cells after Serglycin interference

2.4 Serglycin可作為卵巢癌的預后指標和治療靶點分析TCGA數據庫中卵巢癌數據集，在426例卵巢癌組織中，Serglycin表達顯著高于正常卵巢組織（P<0.05）。KMPLOT進一步分析在卵巢癌患者中Serglycin與預后的關系，Serglycin表達與卵巢癌患者預后呈負相關，Serglycin高表達的患者總生存期較差（平均危險指數：HR=1.26，P<0.001），提示Serglycin可作為卵巢癌一個潛在的治療和預后靶點。見圖4。

3 討論

圖4 Serglycin在卵巢癌的表達和預后的生物信息學分析Fig.4 Bioinformatics analysis of Serglycin expression and prognosis in ovarian cancer

Serglycin是一種主要分布在細胞內的小分子量糖蛋白，也可以分泌和整合到細胞外基質中。其由核心蛋白和附著在其上的多種粘多糖（GAG）組成，根據結合的粘多糖的類型分為：硫酸軟骨素類，如CS?4、CS?6、CS?B和肝素類（heparin/heparin sulfate）［6-7］。細胞內的Serglycin通過調節血管內皮生長因子、蛋白水解酶、TGF?β、IL?8和HGF等分子的釋放，進而激活多條級聯信號通路，促進腫瘤細胞增殖和轉移、上皮間充質轉化（EMT）以及腫瘤細胞干性的維持［8-12］。分泌到細胞外的Serglycin可作為配體與其受體CD44分子結合，進而促進腫瘤的多種惡性行為，如侵襲轉移、耐藥、上皮間充質轉化（EMT）等［13-14］。近期研究也發現Serglycin可通過分泌依賴機制參與三陰性乳腺癌（TNBC）［15-16］、鼻咽癌等多種腫瘤的化療耐藥與轉移［17］。

shRNA干擾是真核生物體內由雙鏈RNA介導的降解同源RNA的現象，能特異性抑制靶基因表達，對基因發生轉錄后進行調控，廣泛應用于基因功能研究［18］。本研究中，構建了2個干擾序列：SKOV3/shSerglycin1#和SKOV3/shSerglycin2#以及相應的空白載體：SKOV3/shCon。并在mRNA水平和蛋白質水平驗證了其敲低效率，顯示shSerglycin1#降低Serglycin效果明顯。進一步用不同濃度梯度的化療藥物順鉑進行處理，發現相對于對照組，敲低Serglycin表達可在不同程度上增強卵巢癌細胞SKOV3對化療藥物的敏感性。

細胞的侵襲能力是衡量腫瘤細胞生物學行為的重要方面。有研究指出腫瘤細胞遷移侵襲能力與其惡性程度較為一致，受細胞自身因素及機體等因素影響。Transwell小室實驗因其具有高重復性，操作簡便易行，目前被廣泛用于腫瘤細胞侵襲模型的建立及檢測。在本研究中，Transwell小室侵襲轉移實驗顯示，與SKOV3/shCon相比，敲低Serglycin基因的卵巢癌細胞，穿膜細胞數明顯減少，表明Serglycin可明顯促進卵巢癌細胞的侵襲轉移能力。

EMT的發生過程中，上皮細胞失去極性，多個EMT相關轉錄因子被激活，間質標志物Vimentin等表達上調，上皮標志物Ecadherin等表達下調，細胞骨架重組，細胞外基質（ECM）降解酶增加，上皮細胞發生轉化，進而轉變為間質細胞類型［19-20］。在胚胎組織發生發育、傷口愈合、器官纖維化、腫瘤進展以及耐藥性的產生等過程中EMT的調控都起了一定的作用［21］。有研究指出，靶向EMT發生可以抑制腫瘤耐藥的發生［22］。本研究顯示在卵巢癌組織中Serglycin可通過轉錄抑制因子ZEB2促進卵巢癌細胞的EMT改變，敲低Serglycin可通過EMT影響腫瘤細胞的侵襲轉移和耐藥。

綜上所述，在卵巢癌中，高表達Serglycin與卵巢癌的侵襲轉移與耐藥性相關，降低Serglycin的表達可抑制卵巢癌的EMT的發生。Serglycin通過促進EMT的發生，導致卵巢癌的化療耐藥和侵襲轉移。然而，Serglycin通過EMT促進耐藥發生和轉移的具體機制還需要繼續探索。同時，本研究發現Serglycin可成為卵巢癌的預后指標和今后潛在的治療靶點，這為臨床上卵巢癌的診治提供了新的理論基礎及方案。