稗屬植物DNA條形碼研究

袁國徽，田志慧，李 濤，錢振官，沈國輝

（上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403）

0 引言

稗屬(Echinochloaspp.)為一年生或多年生禾本科草本植物，在全世界大約有50種（包括亞種和變種），分布于熱帶和溫帶地區[1]。稗屬植物多數為田間雜草，其生態適應性強，分布廣泛，是世界性惡性雜草之一[2]。中國稗屬植物記錄有10個種5個變種，廣布全國各地，在農田15種嚴重危害的雜草中居于首位[3]。不同種的稗屬植物對除草劑敏感性也不相同，但是由于其形態相似，在農業生產中往往將其作為一個草種進行防除[4]。不合理除草劑的使用不僅導致農業資源浪費，而且造成稗屬植物的抗藥性逐漸增強，進一步加大了防除的難度。植物鑒定分類的經典方法主要依據形態特性，但稗屬植物的形態性狀具有高度變異性，即同種類植物在不同的生境中，其形態特征如植株高度、穗長、芒長等均存在變異，這使得稗屬植物的分類鑒定標準難以統一[5]。因此，建立一種分子生物學分類方法作為形態學鑒定的補充方法具有重要意義。

植物DNA條形碼(DNA barcoding)是利用標準化的一個或者幾個DNA序列對物種進行快速、準確的識別和鑒定，該方法不受植物個體形態、生長階段等因素限制[6]。長期以來，高等植物DNA條形碼的研究主要集中在核糖體間隔區和葉綠體基因組的編碼和非編碼區域[7]。核糖體內轉錄間隔區ITS和外部轉錄間隔區ETS是植物DNA條形碼常用的片段[8]。目前，較常見的植物葉綠體DNA條形碼主要有matK、rbcL、rpoC1、rpoB、accD、ndhJ、YCF5、trnH-psbA、trnL-trnF、atpF-atpH、trnD-trnY和psbK-psbI基因等[7]。這些片段可能在不同的類群中存在不同的物種分辨率，因此在利用DNA條形碼基因研究物種分類時，要盡可能把葉綠體DNA條形碼和核DNA條形碼一起進行研究[9]。

本研究選取葉綠體DNA條形碼psbA、trnL-F、matK，及核DNA條形碼ITS和ETS作為候選序列，比較其對稗屬植物的鑒別能力，獲得適用于稗屬植物的標準DNA條形碼序列，為稗屬植物的分子鑒定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為4種稗屬植物，包括無芒稗(E.crusgallivar.mitis)、稗(E.crus-gallivar.crus-galli)、長芒稗(E.caudate)和細葉旱稗(E.crus-gallivar.praticola)，均于2017年9月采集于上海市水稻田。參照《中國植物志》[10]，經詳細的物種特征比對，確定每份材料的物種名稱。每個物種選取3個個體，共計12份樣品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 選取新鮮植物的葉片部分，每份樣品稱取100 mg，使用植物基因組DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取。

1.2.2 PCR擴增和測序 選用5個候選條形碼序列（psbA、ITS、ETS、trnL-F和matK）的引物進行PCR擴增[11-12]，其擴增引物信息見表1。PCR擴增反應體系總體積為50 μL，包括：1 μL基因組DNA模板，1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)，25 μL 2×TransTaq-T PCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司），22 μL ddH2O。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，各引物退火溫度退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環；72℃終延伸10 min。PCR擴增產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，將含有目的條帶的凝膠進行DNA回收。利用pEASY-T1載體（北京全式金生物技術有限公司）連接回收DNA序列，然后轉到大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1中，涂布于LB固體培養基上37℃培養過夜。挑取白色菌落于LB培養液中37℃振蕩培養8～12 h，然后進行菌液PCR鑒定，將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 候選條形碼序列擴增引物信息

1.2.3 數據處理分析 用ClustalX 1.83軟件[13]對序列進行多序列比對。用MEGA 5.2軟件[14]基于K2P模型分別計算種內及種間遺傳距離、序列變異信息，并構建鄰接樹（Neighbor-joining tree，NJ樹）（空隙采用完全缺失處理，bootstrap進行1000次重復抽樣檢驗獲得分支支持率）。為了量化種間變異與種內變異的差異程度，變異分辨率的計算見公式(1)。

2 結果與分析

2.1 候選條形碼序列信息和種內種間差異分析

對5個候選條形碼序列分別進行序列分析（表2），發現psbA序列的長度最短為337 bp，其次是ETS、ITS和trnL-F序列長度分別為472 bp、704～705 bp和951～956 bp，matK序列最長，為1330～1331 bp。ITS和ETS序列的G+C含量介于40%～60%，而psbA、trnL-F和matK序列的G+C含量介于30%～40%。變異位點占比最高的候選條形碼序列為matK，占比最低的候選條形碼序列為ETS。基于K2P模型計算的遺傳距離，可以看出matK序列的種內變異最大，trnL-F、psbA和ITS序列次之，ETS序列最小；各序列種間變異則以psbA最大，ETS序列最小。各候選條形碼序列變異分辨率的大小次序為psbA＞ITS＞ETS＞trnL-F＞matK。變異分辨率越高說明種內變異和種間變異的差異越大，區分能力越強[15]。

表2 候選條形碼序列特征和遺傳變異

2.2 NJ樹分析

為了直觀評價不同候選條形碼序列的鑒定能力，本研究對5個序列分別建立了NJ樹（圖1和圖2）。從核DNA序列ITS構建的NJ樹可以看出（圖1），無芒稗和稗聚于同一支，支持率為64%，長芒稗被分為一支，支持率達到85%；而基于ETS序列構建的NJ樹，長芒稗被分為一支，支持率為86%。從葉綠體DNA序列psbA、trnL和matK構建的NJ樹可以看出（圖2），長芒稗均被分為一支，支持率高于90%。由以上數據可以得出，所有候選條形碼序列均可以對長芒稗進行區分（支持率＞50%），表明長芒稗在系統發育中獨立性相對較強；ITS序列構建的NJ樹將無芒稗和稗聚于同一支，相對于其他序列區分度更高，更加適用于稗屬植物的鑒別。

圖1 基于核DNA序列ITS和ETS構建的NJ樹

圖2 基于葉綠體DNA序列psbA、trnL-F和matK構建的NJ樹

3 結論與討論

除了以形態性狀為主要依據的傳統分類方法以外，分子生物學技術在稗屬植物分類上的應用也越來越廣泛，如RFLP標記[16]、RAPD標記[17]、SSR標記[18]、ISSR標記[19]、AFLP標記[20]和DNA條形碼[21]等技術。相比其他分子生物學技術，植物DNA條形碼技術具有極高的可重復性，并且所需要的引物數量及投入的人力、物力、時間顯著減少[6]。

長期以來，國內外學者一直致力于在葉綠體基因組和核基因中尋找引物通用性高、測序質量好、物種分辨率高的DNA條形碼候選片段[22]。但到目前為止稗屬植物DNA條形碼篩選的相關研究報道較少。Zhang等[11]利用開發的葉綠體DNA條形碼對稗屬植物進行分類研究，其中psbA條形碼將200多份稗屬供試材料分成4組。Yamaguchi等[23]利用葉綠體條形碼trnT-L-F將所采稗屬種的9個種分為5組。葉綠體基因組具有單親遺傳，不發生基因重組的特點，是DNA條形碼的主要來源[8]。然而，單靠葉綠體基因組的信息并不足以解決物種鑒定問題，葉綠體基因組與核基因組相結合才能更準確的鑒定物種[24]，因此本研究所選的DNA條形碼片段既有葉綠體基因片段也有核基因片段。理想的DNA條形碼序列檢測到的種間遺傳變異應明顯大于種內遺傳變異[15]。本研究發現葉綠體基因組psbA和核基因組ITS條形碼序列在稗屬植物中種內變異和種間變異差異較大，其變異分辨分別為60%和50%。從遺傳變異角度來看psbA和ITS條形碼對稗屬植物具有較好鑒別潛能。2011年，中國植物條形碼研究團隊提出將核基因組ITS作為種子植物的核心條形碼之一[25]。同時，發現ITS、ETS、psbA、trnL-F和matK條形碼序列在稗屬植物種內也存在較高變異，與Roy等研究結果一致[26]。在物種的DNA條形碼分子鑒定中，構建NJ樹是一種常用的條形碼評估方法。本研究對5個候選條形碼序列分別建立了NJ樹，結果顯示ITS、ETS、psbA、trnL-F和matK條形碼序列均可以區分出長芒稗，其支持率均大于80%。此外，ITS條形碼序列將無芒稗和稗聚于同一支，可以區分出細葉旱稗。許多研究表明單一DNA條形碼片段難以對所有植物物種進行準確鑒定。Kress等[27]研究發現多組合DNA條形碼片段可以顯著提高植物物種鑒定的正確識別率。Fazekas等[28]提出DNA條形碼的識別能力與組合數目相關。因此，筆者建議將具有較高鑒別潛力的psbA和ITS作為稗屬植物潛在的DNA條形碼片段組合。

從本研究的遺傳變異、構建NJ樹等分析結果來看，單個DNA條形碼序列無法實現對稗屬植物100%的鑒別。5個候選條形碼序列中psbA和ITS對稗屬植物的鑒別潛力最大，而ETS、trnL-F和matK對稗屬植物的鑒別潛力相對較差。由于ITS條形碼序列具有區分細葉旱稗的能力，綜合考慮將ITS作為稗屬植物鑒定的核心條形碼。DNA條形碼對物種的鑒定能力除了與選擇的DNA條形碼片段相關外，還與物種的形成密切有關[9]。Altop等[17]研究發現農業耕作方式、地理位置、除草劑的使用以及氣候的變化等因素都會引起稗屬植物在基因型和形態方面發生變異。因此，DNA條形碼技術不能孤立用于稗屬植物的鑒定，還需要與分類學、細胞學和分子系統學相結合。