羊躑躅八氫番茄紅素脫氫酶基因的克隆及表達分析

肖 政，蘇家樂，劉曉青，孫曉波，何麗斯，陳尚平，周惠民，李 暢

（江蘇省農業科學院休閑農業研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014）

0 引言

羊躑躅(Rhododendronmolle(Blume)G.Don)又名黃杜鵑，是杜鵑花屬中極少數開黃色花的珍稀物種[1]。杜鵑花作為中國十大傳統名花之一，其花色繁多，觀賞期長，然而黃色杜鵑品種卻很稀少，培育黃色杜鵑新品種是全世界杜鵑花育種工作者的一個共同目標。由于杜鵑花種間花粉的親合性不同，多年來育種工作者嘗試不同親本雜交組合來選育杜鵑花黃色新品種，但一直沒成功。隨著基因工程技術快速發展，花色分子育種研究為培育杜鵑花新品種提供了新途徑。

類胡蘿卜素是構成植物不同器官顏色的重要色素，主要分布于植物器官的色素細胞中，使花呈現黃色、橙色或紅色[2]。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是植物類胡蘿卜素生物合成途徑中的關鍵酶，催化無色的八氫番茄紅素合成有色的類胡蘿卜素，在轉錄水平上調控花或果實中類胡蘿卜素的積累[3]。目前，PDS基因已經在多種植物中被克隆和鑒別出來，如火鶴花(AnthuriumandraeanumL.)[4]、矮牽牛(Petuniahybrida)[5]、芝麻(SesameindicumL.)[6]、草莓(FragariaananassaDuch)[7]、向日葵(Helianthus annuusL.)[8]和水仙(Narcissustazettavar.chinensis)[9]等。研究發現PDS基因在番茄中超表達，可以促進番茄果實中番茄紅素的積累[10]。PDS基因沉默后會產生光漂白表型，因此常被用作病毒誘導基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)體系的參照基因[11-12]。VIGS作為一種簡單、快速、高效的研究植物基因功能的技術已經被廣泛應用到植物的基因功能研究中[13]。Kumagai等首次利用煙草花葉病素(tobacco mosaic virus,TMV)在本氏煙(NicotianabenthamianaL.)中成功沉默了植物內源PDS基因[14]。Jackie等[15]以PDS基因為報告基因，利用VIGS技術研究小麥抗葉銹病基因Lr21的功能。目前，在杜鵑屬植物中還未見PDS基因的研究報道，研究PDS基因不僅可以為構建杜鵑VIGS體系提供指示基因，而且對深入研究杜鵑花類胡蘿卜素代謝具有重要的意義。

本研究從羊躑躅花瓣中克隆獲得PDS基因的cDNA（命名為RmPDS），對該基因序列進行生物信息學分析，同時研究該基因在羊躑躅花不同發育時期的表達特異性，擬為羊躑躅花色呈色機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

以江蘇省農業科學院杜鵑花種質資源圃的羊躑躅為材料，分別采集羊躑躅花蕾期(S1)、膨大期(S2)、初花期(S3)和盛花期(S4)的花瓣，用液氮速凍后，然后于-80℃低溫保存。

SMART RACE試劑盒購于Clontech公司；Taq酶、克隆載體pMD18-T、DNA Marker、DH5α感受態細胞等購于全式金生物公司；植物RNA提取試劑盒購于艾德萊生物技術有限公司；DNA回收試劑盒購于愛思進生物技術有限公司。

1.2 羊躑躅RNA的提取

采用柱式RNA提取試劑盒提取花瓣的RNA，用1.0%的變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1.3 羊躑躅PDS基因cDNA全長的克隆

利用NCBI數據庫進行序列比對分析，從羊躑躅轉錄組數據庫中篩選到PDS基因片段序列。用Primer5.0軟件設計3’-RACE特異引物GSP1:CACCTTCTCA GTGTGTATGCGGACAT，5’-RACE 特異引物 GSP2:ATTACCATTATTTAGCAAAAAGTTC。以羊躑躅花瓣的RNA為模板，按照Clontech公司的SMART RACE試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，進行3’-RACE-PCR和5’-RACE-PCR反應。

取3 μL產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行檢測。按照Axygen公司的DNA回收試劑盒說明切膠回收擴增的特異性片段。將回收產物連接至pGEM-T Easy載體，轉化大腸桿菌E.ColiDH5α，篩選陽性克隆進行搖菌，送南京金斯瑞公司測序。將測序結果與已經獲得PDS基因片段序列進行比對拼接，分別在序列5’-端和3’-端設計引物PDS-F：CCCGAATCTGAACTGCGTATTGT和PDS-R：GCACTCTTAGGGATTCGCTGTC進行全長驗證，擴增產物送測序，測得結果與之前的全長進行比對，確定獲得羊躑躅PDS基因的cDNA全長序列。

1.4 羊躑躅PDS基因的生物信息學分析

利用NCBI的Blast程序進行同源比對分析和保守結構域預測，查找PDS基因cDNA開放閱讀框。用ProtParam軟件計算PDS氨基酸的相對分子量、理論等電點和穩定性[16]；用ProtScale分析蛋白的疏水性區域[17]；利用HNN軟件對推測氨基酸序列的二級結構進行分析[18]。

采用DNAMAN8軟件對羊躑躅和其他物種的PDS氨基酸序列進行同源比對，用MEG4軟件對PDS氨基酸序列進行比較，構建系統進化樹[19]。

1.5 熒光定量PCR檢測RmPDS基因表達

應用熒光定量PCR檢測RmPDS基因在羊躑躅不同時期（花蕾期S1、膨大期S2、初花期S3、盛花期S4）花瓣的表達情況。依據羊躑躅PDS基因序列，設計一對熒光定量引物P1:ACGAATTGCTTGCTTCCCG和P2:TTGCCCAAATACCATGTATCTGC。內參基因EF1-α的引物為EF1-F：AAGCGAGAAACATAGCGTGC和EF1-R:TCAAGACACTCATTGCTGCG[20]。

熒光定量PCR采用SYBRGreen PrimeScript RTPCR Kit試劑盒（日本Takara公司）。反應在ABI7300上進行，擴增程序：95℃預變性30 s；再進行40個循環，每個循環分別95℃5 s，60℃31 s。每個反應樣本設3個平行重復。試驗數據采用2-△△CT法分析。

2 結果與分析

2.1 羊躑躅花瓣總RNA提取

提取的羊躑躅花瓣總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量（圖1）。電泳結果顯示28S和18S條帶清晰，28S的亮度約為18S的2倍，表明提取的RNA濃度和純度可滿足下一步實驗要求。

圖1 羊躑躅花瓣總RNA電泳圖

2.2 RmPDS基因的克隆

將羊躑躅花瓣提取的總RNA反轉錄成cDNA作為模板，依據羊躑躅轉錄組數據庫中挑選PDS蛋白的基因序列片段序設計RACE特異引物GSP1和GSP2，利用RACE-PCR技術得到3’-端序列和5’-端序列（圖2-A、圖2-B）。將測序得到的5’-端序列，3’-端序列、中間片段進行電子拼接，得到2098 bp的PDS基因全長序列。設計全長引物擴增獲得羊躑躅RmPDS基因全長序列（圖2-C），測序結果與電子拼接序列一致。

圖2 羊躑躅RmPDS基因的PCR擴增結果

用ORF-Finder軟件對羊躑躅RmPDS基因序列進行分析，該基因包含320 bp 3'-端非編碼區，35 bp 5'-端非編碼區及25 bp PolyA尾巴，開放閱讀框長1743 bp（圖3），預測編碼580個氨基酸，在靠近N-端有一個二核苷酸結合域，靠近C-端有一個類胡蘿卜素結構域（圖4）。該基因已經在GenBank登錄，登錄號為KX230462。

圖3 羊躑躅RmPDS基因序列及推導的氨基酸序列

圖4 羊躑躅PDS與其他物種PDS氨基酸序列的同源性比較

2.3 PDS蛋白結構分析

通過ProtParam軟件預測羊躑躅PDS蛋白分子量為65.42 kD，分子式 C2961H4607N789O839S23，理論等電點(PI)為7.59，帶正電的堿性氨基酸殘基總數(Arg+Lys)為67，帶負電的酸性氨基酸殘基總數(Asp+Glu)為66，由此推斷該蛋白為中性蛋白。分析還發現不穩定系數為39.98，推測屬于穩定蛋白，脂肪指數(Aliphatic index)為89.95，親水性平均系數(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.222，表明該蛋白是一個脂溶性且親水性的穩定蛋白。

Protscale軟件分析結果表明羊躑躅PDS蛋白最大親水區域位于第155個氨基酸(Score:-2.667)，最大疏水性區域位于第115個氨基酸(Score:2.367)。由圖5可見，親水性殘基總數多于疏水性殘基，表明羊躑躅PDS蛋白為可溶性蛋白。

圖5 羊躑躅RmPDS基因疏水性/親水性預測

羊躑躅PDS蛋白二級結構以無規則卷曲為主，占44.83%（圖6紅色區域），其次為α-螺旋占37.93%（圖6藍色區域）；延伸鏈占17.24%（圖6）。

圖6 羊躑躅PDS蛋白氨基酸序列二級結構預測

2.4 進化樹分析

利用NCBI Blast工具分析羊躑躅RmPDS基因序列，發現該基因與其他植物的PDS基因高度同源。RmPDS基因與茶樹(Camelliasinensis(L.)Kuntze)PDS基因的相似性最高，達到87.80%，與葡萄(VitisviniferaL.)PDS基因的相似性為83.33%，與梅(PrunusmumeSiebold&Zucc)PDS基因的相似性為81.07%，與月季(RosachinensisJacq)PDS基因的相似性為80.45%。利用MEGA4軟件采用鄰接法對所選取的18種植物PDS蛋白序列和羊躑躅PDS蛋白序列構建系統進化樹。結果見圖7，單子葉植物水仙、水稻和玉米聚為一類，雙子葉植物羊躑躅、葡萄和煙草等聚為一大類，表明PDS基因的進化基本符合植物分類學分類。其中羊躑躅RmPDS基因與茶樹PDS基因的遺傳距離最近，其次是葡萄(VitisviniferaL.)PDS基因、胡桃(JuglansregiaL.)PDS基因，與玉米(ZeamaysL.)PDS基因和水稻(OryzasativaL.)PDS基因的遺傳距離較遠。

圖7 不同植物的PDS氨基酸序列的系統進化樹

2.5 羊躑躅RmPDS基因在花瓣不同發育時期的表達特性分析

熒光定量PCR檢測結果顯示RmPDS基因在花瓣不同發育時期(花蕾期S1、膨大期S2、初花期S3、盛花期S4)均有表達。隨著羊躑躅花的發育，RmPDS基因表達量逐漸升高，在初花期達到最高，盛花期表達量有所降低（圖8）。

圖8 RmPDS基因在羊躑躅花瓣不同發育時期的表達量

3 結論與討論

本研究成功從羊躑躅花瓣中克隆獲得PDS基因全長，該基因cDNA全長2089 bp，開放閱讀框序列為1743 bp，編碼580個氨基酸。該基因推導的氨基酸序列與茶樹、葡萄、梅和月季的相似性分別為87.80%，83.33%，81.07%，80.45%。利用MEGA4軟件分析植物PDS蛋白的系統進化，發現羊躑躅PDS與茶樹PDS蛋白親緣關系最近，另外單子葉植物與雙子葉植物分別聚為兩類，各小分枝的聚類與傳統的分類結果基本一致，說明PDS蛋白可作為系統進化分析。

PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶，分兩步催化八氫番茄紅素合成ζ-類胡蘿卜素，對高等植物葉片、花和果實的顯色起著重要作用[21-22]。在柑橘和番茄的花或果實中，八氫番茄紅素脫氫酶表達量與花或果實中類胡蘿卜素含量呈正相關[23]。在柿子中，PDS基因表達量隨著果實發育逐漸升高，果實中類胡蘿卜素含量也同步升高[24]。在本研究中，RmPDS基因在羊躑躅開花過程均有表達，表達量隨著花的發育逐漸升高，初花期達到最高，盛花期表達量有所降低，這與羊躑躅花發育過程中類胡蘿卜素的含量變化基本一致[25]，這表明RmPDS基因的表達與羊躑躅類胡蘿卜素的合成密切相關，通過調控RmPDS基因的表達，可以影響羊躑躅類胡蘿卜素的積累，從而調控羊躑躅的花色形成。

類胡蘿卜素作為天線色素，主要分布在類囊體膜上，PDS基因以單拷貝形式存在，其蛋白也位于葉綠體的類囊體上[26-27]。類胡蘿卜素在光合作用中主要起到電子傳遞及光氧化保護劑的作用，PDS基因被沉默后，會引起葉片上出現白色斑點[28]。這種特性很適用于VIGS報告基因，檢測病毒載體是否適合侵染植物。目前VIGS技術已經廣泛應用于水稻[29]、番茄[30]、馬鈴薯[31]和小麥[32]等作物上。杜鵑花屬植物生長周期普遍較長、遺傳轉化難度大，VIGS技術有助于開展杜鵑的基因功能研究。羊躑躅PDS基因的克隆可以為構建羊躑躅VIGS體系提供報告基因，有助于開展羊躑躅花色形成相關基因的功能研究。

本研究首次從羊躑躅中克隆獲得PDS全長基因，對其序列進行生物信息學分析；并對PDS基因在羊躑躅花瓣不同發育階段的表達量進行檢測分析，這為下一步探究該基因在羊躑躅花色形成中的分子機制奠定基礎，也為構建羊躑躅VIGS體系提供支持。