基于組學技術探究甜菜耐鹽機理研究進展

路正禹，王 堽，李任任，崔汝菲，耿 貴

（1黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080）

0 引言

氣候變化、不良灌溉方式以及大量使用肥料等會造成土地鹽堿化問題。據統計，鹽脅迫影響著世界約9.6億hm2的灌溉農地，已成為影響全球農業生產的重要非生物脅迫因素之一[1-2]。因此，進行植物耐鹽性研究不僅可以改善農業產量和糧食安全正相關協同效應，同時也能緩解日益增長的人口與糧食需求關系。甜菜(BetavulgarisL.)屬于藜科甜菜屬，是一種耐鹽較強的作物，通常利用其主根作為制糖原料，是世界用于制糖的重要根系作物，被譽為“耐鹽的糖源”。相較于甜菜的野生祖先濱海甜菜(BetamaritimaL.)而言，當前的甜菜品種雖繼承其一定耐鹽性，但為追求高產量、高含糖量等經濟性狀，其耐高鹽能力卻有所降低[3]。對此，了解甜菜鹽脅迫下的響應和適應機制對增加甜菜鹽脅迫的耐受性，提高鹽堿地下甜菜的質量和產量起到至關重要的作用[4-5]。20世紀以來，育種家們通過篩選外來或野生種質、雜交育種等方法成功培育出新品種[6]，一定程度上促使甜菜產業發展，但此類基于表型選擇的育種技術仍存有局限性[7]。隨著組學(OMICS)技術的不斷發展和壯大，越來越多的人從研究鹽脅迫下甜菜的生理反應轉移至探索甜菜耐鹽機制和闡明分子機理[3]。近些年，基于下一代測序(NGS)、基因編輯系統、基因沉默和過表達的基因組學已提供大量闡明植物非生物脅迫的反應機制[8]。Kreps等[9]通過轉錄組水平發現，常見應激條件下約30%的轉錄組調節敏感。Shinozaki等[10]利用RNA微陣列分析發現，被鑒定的候選基因中有73個由應激誘導。此外，RNA測序技術在植物非生物應激反應相關研究中被廣泛應用[11]。蛋白質組學和代謝組學作為新興技術，對理解復雜的生物系統起到了至關重要的作用。蛋白質組學旨在通過定性和定量方式檢測蛋白[12]，而代謝組學則重點研究低分子量代謝物的整體概況[13]。組學技術相關發現迅速給予甜菜抗應激能力研究新的依據，也為揭示非生物脅迫下甜菜的響應機制提供大量遺傳信息和新的見解。

近年來，越來越多的研究集中于使用不同組學工具對甜菜耐鹽分子機理進行分析，如通過轉錄組學研究鹽脅迫下細胞中的基因轉錄情況、利用蛋白質組學進行蛋白定量分析等或結合基因組學輔助育種。但截至目前，仍未有文章系統報道過有關甜菜耐鹽生理和分子機制的最新研究進展。本研究重點闡述組學相關技術對甜菜耐鹽機理的研究進展，以期通過組學技術為甜菜耐鹽性相關研究提供進一步的理論支持和借鑒。

1 組學相關概述

組學是最近幾十年發展起來的新學科，按照分析目標不同主要分為基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學，其共同構成“系統生物學”[14]。

在后基因時代，生物研究的特點是一系列組學技術的快速發展和廣泛應用。過去幾十年中，生物信息學發展出許多處理、分析和解釋組學數據的新方法。此類組學技術通常基于使用高通量分析方法和生物信息學對生物樣本進行分析。與傳統的研究方法相比，轉錄組學和蛋白質組學具有敏感性強和分辨率高的特點，能夠反應植物涉及生物和非生物應激反應基因的差異表達以及比較不同應激條件下植物體內的蛋白變化[15]。而代謝組學通過研究生物體內源代謝物的種類、數量及其內外因素作用下的變化規律，為了解生物體提供更多線索[16-17]。

近年來，組學工具在研究植物有關生物脅迫以及非生物脅迫上的使用率已大大增加，對于了解植物相應反應及適應機制起到重要作用[18]。這些高敏感度的組學工具可以有效分析植物相關組織，并幫助增進對植物耐受機制的了解。

2 甜菜耐鹽性的轉錄組學研究

轉錄組學作為功能基因組學研究的重要組成部分，是后基因時代中最先發展和廣泛應用的技術。作為一門研究各生物條件下轉錄組變化方式的手段，轉錄組學對研究細胞基因轉錄情況和轉錄調控規律等均有一定幫助。廣義上，轉錄組指RNA分子的集合，包括mRNA、rRNA、IRNA和其他非編碼RNA。RNA序列反應了被轉錄的DNA序列，而RNA合成過程則成為基因表達第一步[15]。

2.1 基于抑制消減雜交技術的甜菜耐鹽轉錄組學研究

基于聚合酶鏈式反應(PCR)技術的抑制消減雜交(SSH)技術是用于識別細胞中差異表達基因的技術，該方法通常用于研究生物和非生物脅迫下植物的分子機制。早期，常采用SSH技術在不同植物中鑒定與耐鹽性相關的差異表達基因[19]。Ma等[20]為進一步研BvM14在鹽脅迫下的響應變化，運用SSH技術探索BvM14在鹽脅迫下轉錄譜的變化，從構建的cDNA文庫中識別出36個差異表達基因，并對其假定功能進行分析，發現其中一個基因S-adenosylmethionine synthetase 2(BvM14-SAMS2)是參與多胺前體S-adenosylmethionine(SAM)生物合成的關鍵酶，且可能在甜菜耐鹽中起重要作用。此外，Wang等[21]利用SSH技術在BvM14中發現了另一基因BvM14-cystatin，且鹽脅迫可誘導其轉錄表達。綜上，相關研究表明SSH技術有助于早期利用轉錄組學鑒定有關甜菜耐鹽性的關鍵基因。

2.2 基于高通量測序技術的甜菜耐鹽轉錄組學研究

現如今，強大的高通量測序技術可用于捕獲基因表達模式，從而更系統地探索關于植物如何應對鹽脅迫等重要問題。

Lv等[22]為確定涉及BvM14耐鹽性的廣譜基因，利用高通量測序技術鑒定不同NaCl條件下BvM14幼苗葉片和根部樣品中差異表達基因，發現此類基因在葉片和根部中差異較大，且大部分差異表達基因集中在氧化還原平衡、信號轉導和蛋白質磷酸化上。此外，該研究還發現參與ROS清除系統的基因中，如抗壞血酸過氧化物酶(CL3421,APX)、超氧化物歧化酶(CL8316,SOD)、硫氧還原蛋白(CL10174,TRX)、谷胱甘肽 S-轉移酶(CL6744,GST)、脫氫抗壞血酸還原酶(CL3618,MDAR)和乙醇酸氧化酶(Unigene16950,GOX)等在甜菜中也均有顯著差異。由此推斷，鹽脅迫下BvM14葉片和根之間ROS基因的轉錄表達存有差異[22]。該結果也間接表明，植物抗氧化系統在調節甜菜耐鹽性中起重要作用[23]。與栽培甜菜相比，濱海甜菜具有更高耐鹽性，因此大量研究以濱海甜菜為研究材料，探索甜菜在鹽脅迫下的轉錄組反應。目前，已鑒定出的差異表達基因被證實與滲透保護、分子陪伴作用和氧化還原蛋白合成有關，表明此類基因可能在甜菜耐鹽性中起關鍵作用[24]。此外，Skorupa等[25]利用高通量測序技術在濱海甜菜和栽培甜菜共有的轉錄本中發現bHLH137是唯一受鹽濃度影響而上調和受鹽脅迫影響最大的轉錄因子。由此推斷，栽培甜菜從濱海甜菜中繼承了耐鹽性狀，并且bHLH轉錄因子是甜菜中鹽脅迫反應的候選調節因子。李昕晏等[26]表明miR160、miR164在植物鹽脅迫的應答過程中起關鍵作用。而孫宗艷在有關甜菜miRNA抗逆性的研究中，采用高通量測序技術對鹽處理下甜菜耐鹽品種和鹽敏感品種的幼苗進行差異鑒定，發現鹽脅迫下miR160和miR164的表達均發生顯著下調，其表明miR160的2個靶基因ARF17、ARF18以及miR164的2個靶基因NAC21/22和NAC100參與鹽脅迫的應答過程[27]。

3 甜菜耐鹽性的蛋白質組學研究

隨著組學研究的不斷深入，蛋白質組學已逐漸成為研究熱點[28]。盡管高通量RNA測序現已在甜菜中鑒定出一些鹽響應基因，但由于轉錄后、翻譯、翻譯后的調控等原因，轉錄組數據通常與蛋白質組數據并無直接關聯[29]。相關研究發現，從RNA seq數據集中發現的5個基因可以通過身份識別與5個蛋白質相匹配，但轉錄后和翻譯后修飾（如磷酸化），mRNA水平與蛋白質的表達水平沒有很強的相關性，而蛋白質的表達水平與鹽脅迫條件下信號傳遞和代謝過程有更直接的關聯[30]。因此，使用蛋白質組學研究甜菜鹽脅迫下的整體蛋白質水平變化則顯得尤為重要。

蛋白質組學旨在通過研究蛋白質結構和功能，以揭示生命的活動規律。其中，二維差異凝膠電泳(2DDIGE)技術和相對和絕對定量的無凝膠同位素標記(iTRAQ)技術在定量不同生物樣品中的蛋白質變化方面顯示出顯示出互補的效用，其均可提高蛋白質組的覆蓋率[31]。此外，磷酸化蛋白質組學也是蛋白質組學研究中的重要課題。

3.1 基于2D-DIGE技術的甜菜耐鹽蛋白質組學研究

Yang等[31]利用2D-DIGE技術從不同鹽處理下的BvM14植株中提取蛋白質，共鑒定出86個蛋白質點，其中葉片67個差異蛋白點，根部22個差異蛋白點。此外，將該研究所得數據與轉錄組學數據相比，發現葉片中13種蛋白質和根中12種蛋白質在基因表達和蛋白質水平上表現出顯著的相關性[32]。

3.2 基于iTRAQ技術的甜菜耐鹽蛋白質組學研究

為探尋植物細胞的膜系統在調節反應和適應鹽脅迫中的作用，Li等[30]利用iTRAQ技術對甜菜BvM14進行比較蛋白質組學研究。該研究發現，Plasma membrane ATPase 11(gi|12230459)和Vacuolar ATPase subunit H protein(gi|29170386)響應鹽脅迫，此類蛋白質參與產生跨膜的質子梯度使離子在質膜和液泡膜間轉運。同時，鹽脅迫下ATP酶的水平和活性的提高對Na+吸收和滲透調節起重要作用[33]，且與Cheng等人的結論一致[34]。此外，Wang等[35]利用iTRAQ技術進行蛋白質組學分析，分別在S210的根和葉中鑒定出47和56個差異表達蛋白，而在T510中，56和50個蛋白分別在其根和葉中發生顯著變化。這些蛋白質被發現參與光合作用、代謝、應激和防御、蛋白質合成以及信號轉導等多方面的功能，其中S210葉片中與蛋白質合成相關的蛋白比例(18%)高于T510(4%)，而信號轉導蛋白在S210葉片和根系中的比例低于T510(分別為5%和8%，9%和13%)。該結果表明，在鹽脅迫下鹽敏感型(S210)甜菜品種和耐鹽型(T510)甜菜品種在蛋白質組學上表現出不同變化。

3.3 基于磷酸化蛋白質組學技術的甜菜耐鹽蛋白質組學研究

蛋白質磷酸化是鹽脅迫下調節和控制蛋白質功能的最基本且最重要機制之一。相關研究利用無標記定量蛋白質組學技術分析短期鹽脅迫下BvM14的磷酸化蛋白質組變化，發現部分關鍵激酶在鹽脅迫下表現出顯著變化，如：MAPKs、14-3-3s、CDPKs[32]。Yu等[36]利用無標記定量蛋白質組學技術和磷酸肽富集技術對M14蛋白質樣品進行全蛋白質組分析，共鑒定出2182個蛋白點，其中189個磷酸化蛋白在磷酸化水平上表現出顯著的變化，114個蛋白在鹽脅迫下也表現出差異。同時，研究還發現MAPKs和14-3-3s為與鹽脅迫相關的信號分子。此外，CK2被證實在耐鹽機制中起至關重要，而過氧化物酶和其他幾種蛋白質的磷酸化也為今后研究植物耐鹽機制提供新的線索[37]。

4 甜菜耐鹽性的代謝組學研究

代謝組學是一門研究代謝組的學科，是通過研究代謝產物揭示生命活動代謝本質的一種科學方法。代謝組分被視為基因表達的最終產物，可定義細胞或組織的生化表型，而細胞代謝物的定量和定性測量可用于監測或評估基因功能[38-39]。應激反應會導致基因表達改變，尤其在植物中，其會導致代謝物庫的質量變化[40]。因此，有關代謝物的鑒定則更顯重要。目前，常用的分析工具為氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-Ms)、高效液相色譜(HPLC)、UV分光光度計、毛細管電泳(CE)等[41]。

然而，有關甜菜鹽脅迫的代謝組學研究較少，且整體仍處于初級階段。Hossain等[42]利用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對葉片和葉綠體中83種代謝物進行鑒定，發現在鹽脅迫下，葉片中參與Calvin-Benson循環、糖酵解和檸檬酸循環的代謝產物顯著減少，而乙醇酸和絲氨酸水平顯著增加。該結果表明，鹽脅迫下甜菜的光呼吸代謝增強。此外，該研究還發現葉綠體中代謝產物腐胺的含量最高，由此推測其有助于提升甜菜在高鹽脅迫下的適應能力，且該結論與Ma等[20]通過轉錄組學與Ji等[43]通過蛋白質組學所得結果一致。

5 甜菜耐鹽性的基因組學研究

自21世紀以來，各組學技術在生物研究的各領域蓬勃發展，研究人員利用轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學不斷發現甜菜有關耐鹽性的基因[44]。而基因組學作為針對基因組規模的組學技術，以基因功能鑒定為目標對所發現的基因進行驗證，并與以全基因組測序為最終目標的結構基因組學相輔相成，被證實有助于包括甜菜在內的諸多作物的育種工作[45]。目前，甜菜的全基因組序列已由Dohm等[46]研究并發表，根據轉錄數據預測出共27421個蛋白質編碼基因，并根據序列同源性進行注釋。與其他具有基因組信息的植物相比，甜菜只具有少量編碼轉錄因子的基因。由此推測，甜菜可能包含與轉錄控制相關的未知基因[44]，因此利用甜菜基因組序列和相關資源，不僅能夠提升由基因型預測表型的精度和效率，還能促進耐受非生物脅迫（例如鹽脅迫）的甜菜品種改良，并為進一步研究潛在的基因調控以及基因環境相互作用的分子機制提供重要基礎。

在鑒定鹽脅迫下M14基因的差異表達中，發現SAMS是參與多胺前體SAM生物合成的關鍵酶。Yang等[29]為進一步確認SAMS在耐鹽性中的作用，從BvM14中分離出BvM14-SAMS2，并在擬南芥中過表達BvM14-SAMS2。該結果表明，BvM14-SAMS2基因在轉基因植株中的過表達可提高植物對鹽和過氧化氫脅迫的耐受性。此外，BvM14中另一差異蛋白：S-腺苷蛋氨酸脫羧酶(BvM14-SAMDC)，也可提升植物耐鹽性。從BvM14葉片中克隆BvM14-SAMDC蛋白的基因，與野生型相比，抗氧化酶活性有所提高。而在擬南芥中過表達，轉基因植株表現出更強耐鹽性，表明BvM14-SAMDC有助于增強甜菜鹽脅迫的耐受性[44]。Li等[47]在BvM14中發現了一種對鹽脅迫反應的差異表達蛋白——BvM14-glyoxalase I。Wu等[48]為進一步研究BvM14-glyoxalase I功能，在煙草中進行過表達，轉基因植株對甲基乙二醛、鹽、甘露醇和過氧化氫有明顯耐受性。這些數據表明BvM14-glyoxalase I在植物耐鹽性中起著重要作用，是提高作物耐鹽性的候選基因。此外，Ji等[43]在BvM14中發現另一個差異蛋白：S-腺苷蛋氨酸脫羧酶(BvM14-SAMDC)。當BvM14-SAMDC過表達時，亞精胺(SPD)和精蛋白(SPM)含量增加，抗氧化酶活性提高。

Kito等[49]在探討甜菜鹽脅迫下絲氨酸生物合成基因的相關研究中，共分離出4個基因，分別編碼BvPGDHa、BvPGDHb、BvSHMTa和BvSHMTb。鹽脅迫后發現甜菜葉片和根系BvPGDHa的mRNA轉錄表達顯著增強，而BvPGDHb的mRNA轉錄表達顯著降低；葉片和根系中BvSHMTa瞬時表達，但BvSHMTb的表達水平尚未改變。由此推測，BvPGDHa和BvSHMTa在甜菜鹽脅迫中起重要作用。

鈉/質子交換泵(NHX)可保證植物體內離子處于穩態，因此大多數植物NHX基因的表達受鹽脅迫影響。Adler等[50]在研究中發現，鹽敏感植物和耐鹽植物NHX基因之間的區別在于其表達模式和調控方式，而不在于基因序列的差異。為研究甜菜BvNHX基因家族，Wu等[51]以擬南芥AtNHX的多肽作為查詢，篩選甜菜的silico基因組，對其進行基因鑒定。結果表明，在甜菜基因組中共鑒定出5個編碼NHX的全長基因，這些BvNHX基因的序列分析表明，CDS在1560 bp(BvNHX2)到3489 bp(BvNHX5)之間，預測蛋白的長度在519～1162個氨基酸之間。亞細胞定位分析表明BvNHX1、BvNHX2和BvNHX3位于液泡上，BvNHX4位于內膜上，BvNHX5位于質膜上。而BvNHX磷酸化位點的數目也有不同：絲氨酸20(BvNHX2)到64(BvNHX5)，蘇氨酸11(BvNHX4)到36(BvNHX5)，酪氨酸范圍從2(BvNHX2和BvNHX4)到8(BvNHX5)。由此表明，絲氨酸為最常見的磷酸化位點。此外，在擬南芥中還鑒定出的6種NHX(AtNHX1-6)基因，其中AtNHX3也已被證實在甜菜中的表達可增強轉基因植株對高鹽的抗性[40]。而將AtNHX1導入芽尖，獲取具有較高耐鹽性轉基因植株的研究表明，甜菜細胞中引入AtNHX1可明顯提高甜菜細胞耐鹽性[52]。因此，引入可提升植物耐鹽性的外源基因，不僅有助于培育新的高耐鹽甜菜品種，還能大大縮短育種進程，使鹽田大面積開發成為可能[53]。

甘氨酸甜菜堿(GB)作為重要的滲透保護劑，是由膽堿的兩步氧化合成而來[54]。由于許多作物沒有GB生物合成途徑，因此GB相關基因工程有助于提高作物對脅迫的耐受性[55]。膽堿單加氧酶(CMO)為催化該途徑的第一步，被認為是GB生物合成的限速步驟。為探討CMO對甜菜GB積累的影響，Yamada等[56]利用攜帶反義BvCMO基因的轉基因植株與野生型植株進行比對，發現轉基因植株表現出CMO合成GB活性下降。此外，轉基因植株和野生型植株除幼葉和貯藏根外，GB含量相似，且轉基因植株對鹽脅迫的敏感度高于野生型植株。

6 總結與展望

本研究綜述了轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、基因組學在甜菜耐鹽機理中的研究進展，并介紹了與甜菜響應鹽脅迫相關的基因與蛋白（見圖1）。使用轉錄組學和蛋白質組學技術研究甜菜鹽脅迫下的耐受機制，在研究領域中具有競爭優勢，而基因組學為甜菜提供來自全基因組的數據支持和藍圖。目前，研究者已通過轉錄組學、蛋白質組學篩選出提高甜菜耐鹽性的關鍵候選基因，如BvM14-SAMS2、BvM14-glyoxalaseI、BvNHX等，并利用基因組學對所發現基因進行驗證，而有關甜菜代謝組學的研究略顯不足。

圖1 甜菜耐鹽相關組學研究

未來，代謝組學將被廣泛應用于實際研究中。并通過輔助其他組學研究，彌補表型與基因型間差異，為植物適應環境脅迫提供一個更廣闊、更深入和更完整的視角。此外，多學科技術的相互融合已成為當今主流，構建多學科、多平行、多維度的研究構架與理論體系尤為重要。因此，下一步應不斷深化各組學技術間的融合，強化多學科交叉融合意識并積極創新，以發掘更多優質的甜菜耐鹽遺傳種質資源與基因資源。以期從新的視角和解決方向，使人們更便捷、更高效的理解植物應對各類脅迫的耐受機制，也使人們更全面、更直觀的了解生物系統。