浙江天目山蟬花蟲草的分離及基質栽培

饒雨欣，郎茂榮，江宏，童小青，王勇軍*

(1.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300； 2.杭州臨安華茵生物技術有限公司，浙江 杭州 311300)

蟬花蟲草(Cordycepscicadae)又名蟬茸、蟲花、蟬蟲草、蟬茸菌，為蟬棒束孢菌真菌寄生于蟬若蟲后形成的菌蟲復合體，是我國一種傳統的藥食兩用真菌。宋代唐慎微《經史證類備急本草》記載“味甘，寒，無毒；主小兒天吊，驚癇螈，夜啼心悸；所在皆有，七月采；生苦竹林者良，花出土上”。在現代醫學中，蟬花含有糖原、甘露醇、多種生物堿、蛋白質、多種氨基酸及多種微量元素等化學成分，具有免疫調節、代謝調節、解熱鎮痛、鎮靜催眠、改善腎功能、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[1-2]。蟬花蟲草為世界性廣布種，在我國分布于秦嶺淮河以南，主要生長于熱帶和亞熱帶的闊葉林、針闊葉混交林及竹林等生境中[3]。蟬花蟲草的寄主主要包括山蟬Cicadaeflammata、蟪姑Platypleurakaempferi、黑蚱Crytotympanapustulata、竹蟬Platylomiapieli等蟬科昆蟲[4]。筆者在浙江省杭州市天目山區進行資源調查時發現，蟬花蟲草廣泛分布于竹林中，長期被當地竹農采收并作為藥用真菌。本研究從天目山竹林土壤感染竹蟬中分離獲得1株蟬花蟲草菌株TM06，并進行了人工栽培探索，為蟬花蟲草資源開發提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟬花蟲草菌株

蟬花蟲草分離物TM06采集于浙江省杭州市臨安區天目山竹林(119°31′1″E 30°20′7″N)土壤感染的竹蟬。

1.1.2 培養基

PDA培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

M1液體培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖30 g，K2HPO40.5 g，MgSO41 g，檸檬酸銨1 g，蛋白胨3 g，復合維生素B 150 mg，水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

小麥基質培養基。每個玻璃培養瓶(5 cm×5 cm×10 cm)分別裝入約25 g小麥和20 mL的M1液體培養基，添加不同量的蟬蛹粉，混勻后121 ℃滅菌30 min。

市售蟬蛹粉，過0.15 mm篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離

用小鏟子取露出蟬花的蟲體，拭去黏附土壤，置于取樣袋中，放入冰盒帶回實驗室進行分離純化。用剪刀剪取蟬花組織，表面用75%酒精消毒10 s后，用無菌水進行沖洗2遍后，用鑷子撕開表皮，取長、寬為1 mm大小的組織塊，接種于PDA培養皿中，避光條件下24 ℃培養。待菌絲長出，用挑針挑取少量菌絲置于新鮮PDA培養皿中進行培養，觀察菌絲形態，獲得純培養物。

1.2.2 ITS-PCR及序列測定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工?，上海)進行真菌菌絲總DNA的提取，采用真菌核糖體基因間隔區(ITS)通用引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCC TCCGCTTATTGATATGC3′)對基因組DNA進行PCR擴增。擴增體系為94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1 min，30個循環；72 ℃，8 min。將擴增得到的DNA片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序，采用DNAMAN軟件進行拼接。序列采用MEGA 7.0軟件進行系統發育樹構建，采用Maximum Likelihood analysis進行分析，自展數據(bootstrap)為1 000次[5]。

1.2.3 蟬花蟲草的人工栽培

取在PDA培養基生長的蟬花蟲草菌絲塊，置于M1液體培養基中，160 r·min-1，22 ℃黑暗條件進行震蕩培養，培養6 d，至菌絲小球長出，用小型攪拌器混勻后，吸取1 mL菌液添加至含有不同濃度蟬蛹粉的小麥基質培養基，黑暗條件22 ℃下進行培養，待菌絲長滿培養瓶，進行光照誘導(黑暗12 h/光照12 h)，待生長成熟后，取子座組織進行稱重。

1.3 數據統計與分析

采用SPSS v.19數據系統進行統計分析，采用Duncan’s新復極差法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蟬花蟲草TM06的分離培養及人工基質栽培

采集的蟬花是由蟲體和孢梗束兩部分組成的生物體，寄生的蟬若蟲較大，表面披覆著灰白或灰黃色的茸毛狀菌被。蟬花子座一般單生、2個或多個，不分支，呈棒狀、褐色；蟬花的孢梗束由蟬的前端長出，單生或叢生，上部反復分枝，分枝頂端膨大(圖1中A)。蟬花菌絲在PDA培養基上菌絲白色，稀松，底部產紅色色素，易形成孢子(圖1中B)。

蟬花蟲草TM06菌株在小麥基質培養基上培養將近10 d后，白色菌絲布滿整個基質；15 d后，子座形成，有子實體長出，菌體顏色加深，呈淡黃色；40 d后，子實體生長茂密，高5～7 cm，直徑1～3 mm，頂部有大量珊瑚狀分支，子實體成熟(圖1中C)。

圖1 蟬花蟲草TM06的分離(A和B)及基質栽培(C)

2.2 蟬花蟲草TM06的ITS遺傳系統分析

利用引物ITS1和ITS4進行PCR 擴增，獲得蟬花蟲草TM06的ITS部分序列，NCBI登錄號為MW040504。利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，分析結果顯示，TM06與蟬花蟲草QCS2007071701菌株和JGS2014061604菌株親緣關系最近，構成1個分支(圖2)。

圖2 基于ITS序列構建的系統發育樹

2.3 添加不同濃度的蟬蛹粉對TM06子實體產量的影響

在小麥基質培養基中分別添加2%、5%、10%和15%(重量百分比)的蟬蛹粉，測定蟬蛹粉對蟬花蟲草TM06子實體生長的影響。由表1可知，小麥基質培養基中添加蟬蛹粉后，子實體干重明顯提高。其中，添加5%的蟬蛹粉效果最佳，子實體每瓶平均干重達到11.61 g。同時發現，蟬蛹粉添加超過10%時，反而降低了子實體的產量。

表1 不同濃度蟬蛹粉對蟬花蟲草TM06子實體產量的影響

3 小結與討論

蟲草屬真菌的資源挖掘和人工栽培，是當前研究和開發的熱點，對功能食品開發和野生資源保護均具有重要意義[6]。本研究從浙江天目山竹林感染的蟬若蟲上分離獲得1株蟬花蟲草TM06，采用小麥基質培養基完成了該菌株的人工栽培，并測定了蟬蛹粉對TM06菌株人工栽培下的增效作用。研究結果明確了浙江天目山竹林蟬花的菌種特性，并建立了人工栽培技術。蟬花蟲草的藥理成分及藥效功能已取得重要進展[1,7-8]，但不同來源、不同栽培方式的蟲草，在藥理成分及功效上可能存在差異[9]。下一步將圍繞人工栽培的蟬花蟲草的藥理學成分及功效開展研究。