血清KL-6、DD及CRP在ANCA相關性血管炎合并間質性肺病檢測中的臨床價值①

譚立明 盧曉霞 張 倩 黃家翌 宮陽陽 張皓承 劉宇晗 余建林

（南昌大學第二附屬醫院，南昌 330006）

抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎（antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis，ANCA-associated vasculitis，AAV）是一類以血清AN?CA檢測陽性和中小型血管炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病，主要包括顯微鏡下多血管炎、肉芽腫性多血管炎和嗜酸性肉芽腫性多血管炎三種類型，主要影響腎、肺和其他器官［1-2］。最新研究表明AAV患者的標準化死亡率是健康人的2.7倍［3］。AAV合并間質性肺病（interstitial lung disease，ILD）在臨床上較為常見，診斷方法主要為病史分析、臨床檢查、影像學分析和ANCA檢測，但由于檢查存在不良反應或費用較高等，不易被一般患者所接受。研究表明，血清Ⅱ型肺泡細胞表面抗原（krebs von den-lun?gen-6，KL-6）在結締組織?。╟onnective tissue dis?ease，CTD）合并ILD中高表達，可以反映ILD的活動程度［4］；D-二聚體（D-dimer，DD）為凝血指標，在活動期的AAV中高表達，且與ILD的發生密切相關［5-6］；C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）為炎癥指標，與AAV的活動性相關。本研究選取南昌大學第二附屬醫院45例AAV-ILD患者、42例AAV患者和40例健康體檢者作為研究對象，旨在探究血清KL-6、DD及CRP檢測對AAV-ILD的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取南昌大學第二附屬醫院2015年5月至2019年7月確診的45例AAV-ILD患者，42例AAV患者，40例健康體檢者。AAV的診斷符合2012年美國Chapel Hill Consensus Conference關于ANCA相關性血管炎的診斷標準［7］；ILD確診條件：①臨床表現有漸進性氣促、干咳、活動性呼吸困難，肺部聽診有散在或彌漫的濕啰音；②肺功能檢查表現出不同程度的彌散量減少及限制性通氣功能障礙；③肺部高分辨率CT（high-resolution CT，HRCT）有下列影像學變化，如肺內呈現不規則線條網格樣改變、雙下肺外側出現蜂窩影、小葉間隔增厚、磨玻璃影等多種表現。研究對象均知情同意，并且本研究獲得南昌大學第二附屬醫院倫理委員會批準許可。

1.1.2 納入標準 ①所有患者知情并同意本研究；②患者診斷明確，臨床資料詳實；③所有健康體檢者的臨床表現、病理、影像學及實驗室血清學檢查均無異常變化。

1.1.3 排除標準 ①繼發性血管炎；②合并其他肺疾病，如：肺結核、肺部感染、支氣管擴張及肺部腫瘤等；③合并其他自身免疫性疾病；④合并心、腦、肝、腎及血液系統等嚴重疾病；⑤合并肝炎、艾滋病等傳染性疾?。虎奕焉锘虿溉槠趮D女。

1.1.4 試劑和儀器

1.1.4.1 KL-6的檢測試劑由日本積水醫療科技（中國北京）有限公司提供，儀器為AU5400全自動生化分析儀。

1.1.4.2 DD的檢測試劑由日本積水醫療科技（中國北京）有限公司提供，儀器為全自動血凝分析儀Sysmex CS-5100。

1.1.4.3 CRP的檢測由美國貝克曼公司提供的IM?MAGE 800型全自動特定蛋白分析系統及配套試劑完成。

1.1.4.4 ANCA的檢測試劑由德國歐蒙醫學實驗診斷股份有限公司提供，EUPOStarⅢPlus熒光顯微鏡由德國EVROIMMUN公司提供。

1.1.4.5 抗髓過氧化物酶抗體（MPO）和抗蛋白酶3抗體（PR3）的檢測試劑盒由歐根泰克診斷股份有限公司生產，儀器為KHBST-360酶標儀(上海科華生物工程股份有限公司)、PW-960全自動洗板機[記憶科技(深圳)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 所有研究對象空腹采3.0 ml外周靜脈血2份，一份置于枸櫞酸鈉抗凝管中并搖晃均勻，2 500 r/min離心15 min，用于檢測DD濃度；一份置于非抗凝管中靜置30 min后，2 500 r/min離心15 min，用于檢測KL-6和CRP濃度及ANCA。

1.2.2 KL-6的檢測 操作步驟：輸入樣品號，輸入預先設置的項目組合號，選擇檢測項目KL-6，輸入對應樣品號所做的項目信息，將樣品架放入進樣軌道，點擊開始。所有操作均嚴格遵循試劑說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準。

1.2.3 DD的檢測 操作步驟：輸入樣本號，選擇檢測項目DD，將樣品架放入進樣軌道，點擊開始。所有操作均嚴格遵循試劑說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準。

1.2.4 CRP的檢測 采用速率散射比濁法測定CRP，操作步驟：輸入樣本識別，確定架號和樣本號，選擇檢測項目CRP及樣本類型，保存設置，點擊開始。以上所有操作均嚴格遵循試劑說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準。

1.2.5 ANCA的檢測

1.2.5.1 采用間接免疫熒光法測定ANCA操作步驟：將患者稀釋的血清與生物載片（反應區內固定有包被基質的生物薄片）溫育30 min后進行沖洗，再加入熒光素標記的抗人抗體溫育30 min，沖洗后進行封片，最后于顯微鏡下觀察熒光模型。實驗中建立質量控制，每分析批使用試劑盒中匹配的陰陽性對照物進行檢測，同時使用自制的弱陽性質控物進行檢測。

1.2.5.2 采用ELISA測定MPO和PR3操作步驟：將質控品和稀釋的患者血清分別加入包被過氧化物酶和蛋白酶3的微孔板中，加速儀內溫育15 min后洗液洗板3次，加辣根過氧化物酶標記的多克隆抗人IgG類抗體，加速儀內溫育7.5 min，洗板5次，加底物后加速儀內避光溫育7.5 min，加終止液，30 min之內用450 nm波長比色，計算結果。以上所有操作均嚴格遵循各試劑說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準。

1.3 統計學處理 數據分析采用SPSS24.0統計學軟件。首先對數據進行正態性檢驗，正態分布資料以±s表示，比較前采用Levene's Test進行方差齊性檢驗，方差齊性的兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊的兩兩比較采用t'檢驗；計數資料以例數（n）或率（%）表示，比較用χ2檢驗；根據統計數據繪制受試者工作特征（receiver operating characteris?tic，ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC），AUC在0.5～0.7有較低診斷準確性，AUC在0.7～0.9有一定診斷準確性，AUC＞0.9有較高診斷準確性，當P＜0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料比較AAV-ILD組年齡36～85歲，平均（63.29±14.37）歲，AAV組年齡20～88歲，平均（58.12±15.74）歲，健康對照組年齡18～85歲，平均（53.63±18.36）歲，3組的平均年齡比較，差異無統計學意義（F=2.775，P=0.066）；AAV-ILD組男女比例為1∶0.55，AAV組男女比例為1∶1.1，健康對照組男女比例為1∶1，3組比較，差異無統計學意義（χ2=2.920，P=0.232），詳見表1。

表1 各組患者臨床特征的比較Tab.1 Comparison of clinical features of patients in each group

2.2 血清KL-6、DD及CRP檢測水平比較AAVILD組患者血清KL-6和CRP水平與AAV組和健康對照組比較，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）；血清DD水平與AAV組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），與健康對照組比較，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 血清KL-6、DD及CRP檢測水平比較（±s）Tab.2 Comparison of serum KL-6，DD and CRP levels（±s）

表2 血清KL-6、DD及CRP檢測水平比較（±s）Tab.2 Comparison of serum KL-6，DD and CRP levels（±s）

Note：Compared with AAV and control group，1）P＜0.01；compared with AAV，2）P＜0.05；compared with control group，3）P＜0.01.

n Groups AAV-ILD AAV Control CRP（mg/L）78.01±37.721）51.41±28.943）6.90±3.39 45 42 40 KL-6（U/ml）715.95±265.991）266.48±101.14 251.11±98.14 DD（μg/ml）4.88±3.032）3.61±2.133）0.30±0.13

2.3 血清ANCA檢測結果比較AAV-ILD和AAV組的p-ANCA、c-ANCA陽性率均大于健康對照組，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）；AAV-ILD和AAV組內，p-ANCA陽性率均大于c-ANCA陽性率，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），詳見表3。

表3 血清ANCA檢測結果比較［例（%）］Tab.3 Comparison of test results of serum ANCA［n（%）］

2.4 血清KL-6、DD及CRP的診斷效能KL-6的靈敏度和特異度都很高；DD的靈敏度最高，但特異度很低；CRP的靈敏度較高，特異度一般，詳見表4。

表4 血清KL-6、DD及CRP的診斷效能比較Tab.4 Comparison of diagnostic efficacy of serum KL-6，DD and CRP

2.5 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲線分析 根據3組患者血清KL-6、DD及CRP水平計算出ROC曲線參數，繪制ROC曲線，其中KL-6對AAV-ILD的診斷價值最高，詳見表5和圖1。

表5 標志物的ROC曲線參數Tab.5 Parameters of biomarker′s ROC curves

2.6 各血清標志物的聯合檢測 將檢測指標聯合，進行串并聯分析，計算聯合后診斷AAV-ILD的敏感度和特異度。串聯檢測可顯著提高診斷特異度，其中KL-6+DD+CRP串聯時最高，為0.995；并聯檢測可顯著提高診斷敏感度，其中KL-6+DD+CRP并聯時最高，為0.999。所以聯合檢測對AAV-ILD診斷意義更大，詳見表6。

圖1 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲線Fig.1 ROC curves of serum KL-6，DD and CRP

表6 各血清標志物的聯合檢測（%）Tab.6 Joint detection of serum markers（%）

3 討論

AAV是一種嚴重的自身免疫性疾病，主要影響中小型血管且常累及其他器官。AAV的臨床表現多種多樣，從最初的皮疹可發展到多系統疾病，往往導致診斷上的明顯延遲［8］。ILD是AAV常見的并發癥之一，合并ILD的AAV患者病死率較高，早期診斷對于治療和預后有重要意義。目前，HRCT是AAV-ILD診斷的重要手段，但難以做到早期診斷和檢測病情的變化。因此，尋找診斷價值高的實驗室指標尤為重要。

KL-6是日本人KOHNO等［9］于1985年發現并命名的高分子量（200 kD）糖蛋白，由MUC1基因編碼，主要在Ⅱ型肺泡細胞表面表達，肺泡上皮細胞受破壞后會導致血清中KL-6的水平升高，因此KL-6可鑒別診斷各種慢性肺纖維化和肺泡蛋白沉積，目前已有研究報道KL-6為診斷ILD、評估病情嚴重程度和預后的一種有效的生物標志物［10-14］；DD來源于纖溶性交聯纖維蛋白凝塊，主要用于排除肺動脈栓塞和輔助診斷急性主動脈夾層，其含量在AAV的活動期患者中顯著高于緩解期，對AAV-ILD患者的診斷價值研究尚少［15-16］；CRP是全身性炎癥反應的標志物，可反映AAV的病情活動程度，在大部分AAVILD患者中顯著升高，但屬非特異性指標，其對AAV-ILD的診斷價值少有研究。

本研究發現，AAV-ILD組血清KL-6水平明顯高于AAV組和健康對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01），AAV組KL-6水平和健康對照組相比差異無統計學意義，這與YASUNORI IWATA等［17］的研究結果相似，說明AAV-ILD患者血清中KL-6水平的升高與AAV無關，而是由并發的ILD造成。本研究還發現AAV-ILD組血清DD及CRP水平高于AAV組和健康對照組，且AAV組高于健康對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。以上研究結果提示KL-6、DD及CRP可作為輔助診斷AAV-ILD的血清學指標，經分析得出三者單獨檢測時的診斷效能，發現KL-6的敏感度為0.844，特異度為0.963，具有最大的診斷價值；DD和CRP的靈敏度均較高，但特異度比較低，DD的特異度僅為0.524，表明二者單獨檢測時診斷價值不大。

ANCAs是一組針對中性粒細胞和單核細胞胞漿成分的抗體，是診斷AAV的重要血清學指標，主要分為核周型（p-ANCA）和胞質型（c-ANCA）。本研究中，AAV-ILD組的ANCA陽性率顯著高于健康對照組，與AAV組ANCA陽性率無統計學差異，說明AAV并發ILD對ANCA結果沒有顯著影響，同時也提示ANCA不是輔助診斷AAV-ILD的血清學指標。此外，AAV-ILD和AAV組內p-ANCA陽性率均高于c-ANCA，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），這與NISHKANTHA ARULKUMARAN等［18］的研究結果相似，說明AAV并發ILD之后對ANCA的陽性類別沒有顯著影響。

通過比較血清KL-6、DD及CRP單獨檢測時ROC曲線下面積，發現KL-6的曲線下面積最大，為0.932，說明其具有很高的診斷價值，這是因為KL-6主要在Ⅱ型肺泡細胞表面表達，當肺組織受到損傷時，血清中KL-6水平升高，而AAV組和健康對照組的肺組織并未受到損傷，血清KL-6水平基本不會升高［19］。聯合檢測時，KL-6+DD+CRP串聯檢測的特異度最高，為0.995；并聯檢測的靈敏度最高，為0.999，表明聯合檢測的輔助診斷價值明顯優于單獨檢測。此外，KL-6+DD和KL-6+CRP串聯檢測的特異度較高，KL-6+DD、KL-6+CRP和DD+CRP并聯檢測時的靈敏度均較高，因此在臨床工作中，需要根據具體情況選擇合適的檢測方法。

綜上所述，血清KL-6、DD及CRP這3項指標在AAV-ILD患者中高表達，單獨檢測KL-6具有較高的診斷價值，三者聯合檢測可顯著提高AAV-ILD輔助診斷的診斷效能、靈敏度和特異度，具有較大的臨床價值。