人乳腺珠蛋白熒光免疫層析檢測方法的建立①

崔云會 陳 楠 王云龍 明 亮 李玉林 王繼創(chuàng)

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州 450052）

乳腺癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，近年來在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢［1］。生物標記物的使用已經(jīng)成為幫助乳腺癌診斷以及確定預后、預測治療反應和治療后監(jiān)測的一種方法，非侵入性的生物標記物，如血清學分子，與其他類型的生物標記物相比，檢測更方便［2-3］。人乳腺珠蛋白（human mamma?globin，hMAM）是子宮珠蛋白基因家族中的一個乳腺特異性成員，編碼定位于染色體11q13上的10kDa糖蛋白［4］。hMAM在乳腺上皮細胞中低表達，在乳腺癌中高表達，已被證明與腫瘤早期發(fā)現(xiàn)轉移有關［5］。且有研究表明，血液中的hMAM可作為乳腺癌的一個獨立預后標志物，并且已成為乳腺癌微轉移檢測的最特異的標志物之一［6］。本研究以鑭系稀土元素Eu3+羧基熒光微球作為標記物，建立hMAM時間分辨熒光免疫層析檢測方法，為乳腺癌診斷和治療監(jiān)測提供一種快捷、準確且經(jīng)濟的方法。

1 材料與方法

1.1 材料SCGB2A2單克隆抗體購自Abnova公司，Eu3+羧基熒光微球購自Bangs公司，羊抗鼠IgG、hMAM多抗、hMAM室內(nèi)參考品均由河南省生物工程技術研究中心提供，PVC板購自上海良信公司，硝酸纖維素膜（NC膜）購自Sartorius公司，玻璃纖維棉購自上海金標生物科技有限公司，Human mam?maglobin ELISA試劑盒購自Cusabio公司，臨床樣本由鄭州大學第一附屬醫(yī)院提供，其他化學試劑均為分析純。免疫熒光定量檢測儀購自杭州峰航科技有限公司，XYZ三維點膜噴金儀、微電腦自動斬切機購自上海金標生物科技有限公司，超微量紫外分光光度計購自Thermo fisher公司，超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司，納米粒度電位儀購自Malvern公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫微球制備 采用EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺）和NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）化學偶聯(lián)的方法活化微球，取50μl熒光微球加入1 ml 20 mmol/L MES溶液，漩渦振蕩混勻后，加入20μl EDC溶液（10 mg/ml）和200μl NHS溶液（20 mg/ml）作為活化劑混勻后，低速搖床振蕩活化1 h；15 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 ml0 mmol/L MES，沉淀用500μl MES（20 mmol/L）旋起，超聲分散；再加入10μg hMAM標記抗體，偶聯(lián)2 h；15 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 ml封閉液，超聲后搖床振蕩2 h；加入微球保護液500μl復溶沉淀，超聲后備用，并用粒度儀檢測偶聯(lián)抗體后的標記微球與純凈微球粒徑大小均一性。

1.2.2 試紙條構建 用XYZ三維點膜噴金儀將1.0 mg/ml的hMAM包被抗體、2.0 mg/ml羊 抗 鼠IgG以1μl/cm的量包被于NC膜上，分別作為檢測線T線、質控C線，并于37℃干燥2 h。將1.2.1制備好的微球混勻后，按8μl/cm均勻噴在微球墊上，置于37℃干燥2 h；依次將樣品墊、微球墊、包被有T線、C線的NC膜和吸水紙組裝在PVC板上，用自動斬切機裁成3.9 cm寬的試紙條。

1.2.3 試紙條檢測 在樣品墊上滴加70μl樣品，10 min后放置于免疫熒光定量檢測儀上檢測，通過T線、C線熒光強度分析樣品中的hMAM濃度。

1.2.4 工藝條件優(yōu)化 在實驗室前期研究基礎上，設計四因素三水平正交實驗確定最優(yōu)的MES緩沖液量、熒光微球量、超聲功率、超聲時間，選擇20 mmol/L MES緩沖液量為500、1 000、1 500μl，微球量為40、50、60μl，超聲功率為60、80、100 W，超聲時間0.5、1、2 min，按照1.2.1、1.2.2的工藝流程制備試紙條。

1.2.5 分析性能評價

1.2.5.1 建立標準曲線 取濃度為0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml的hMAM線性標準品，重復檢測3次，以hMAM濃度為橫坐標，相應的T/C均值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5.2 精密性 隨機抽取3批試紙條，分別檢測低、中、高值的hMAM樣本，每個濃度重復測定10次，分析3個批次批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）。

1.2.5.3 準確度 用基質血清將20 ng/ml的hMAM室內(nèi)質控品稀釋成預測濃度為3、10、17 ng/ml樣品，采用本方法制備的hMAM免疫層析試紙條檢測，分別計算其回收率，回收率=（實測濃度/預測濃度）×100%。

1.2.5.4 特異性 將CEA（20 ng/ml）與CA153（50 U/ml）分別與濃度為15 ng/ml的hMAM室內(nèi)質控品等體積混合后，重復檢測10次。

1.3 方法學比對 應用本研究建立的hMAM熒光免疫層析試紙條與CUSABIO公司Human Mamma?globin ELISA試劑盒平行檢測46例乳腺癌樣本的外周血中hMAM的含量，并進行相關性分析。

2 結果

2.1 免疫微球制備 采用熒光層析工藝進行微球與抗體偶聯(lián)，偶聯(lián)微球與純凈微球粒徑檢測結果如圖1所示：均為單一峰，且偶聯(lián)前后粒子分布均一性較好（PDI＜0.20），說明采用本實驗方法偶聯(lián)微球效果較好。

圖1 標記微球與純凈微球粒徑強度與體積分布Fig.1 Particle size intensity and volume distribution of la-beled microspheres and pure microspheres

2.2 工藝條件優(yōu)化 四因素三水平正交實驗結果如表1所示：由極差分析可得，最優(yōu)組合為MES緩沖液量1 000μl、微球50μl、超聲功率100 W、超聲時間1 min。

表1 四因素三水平實驗結果Tab.1 Four-factor three-level experimental results

2.3 分析性能評價

2.3.1 標準曲線的建立 本實驗建立的熒光層析方法檢測結果如圖2所示：y=0.177x+0.097，R2=0.992 3。線性范圍為0.312～20 ng/ml。

圖2 熒光免疫層析法檢測人乳腺珠蛋白標準曲線Fig.2 Standard curve of mammoglobin detection by fluo-rescence chromatography

2.3.2 精密性 采用本方法制備的試紙條檢測濃度分別為3、10、17 ng/ml的樣品，批內(nèi)變異系數(shù)分別為7.65%、8.74%、8.97%，均小于10%；批間變異系數(shù)分別為11.72%、9.43%、12.95%，均小于15%，精密性符合要求。

2.3.3 準確度 采用本研究制備的熒光層析試紙條檢測高、中、低值回收率結果如表2所示，低、中、高值回收率分別為101.7%、101.2%、104.9%，均符合回收率85%～115%的要求。

表2 回收率檢測結果（±s）Tab.2 Four-factor three-level experimental results（±s）

表2 回收率檢測結果（±s）Tab.2 Four-factor three-level experimental results（±s）

Sample Recovery rate（%）Low value Median value High value Predicted concentration（ng/ml）3 10 17 Detection concentration（ng/ml）3.05±0.14 10.12±0.30 17.83±0.97 101.7 101.2 104.9

2.3.4 特異性 特異性檢測結果如表3所示，與乳腺癌常見的血清標志物無明顯交叉反應，表明試紙條特異性較好。

表3 特異性檢測結果（±s，ng/ml）Tab.3 Specificity for hMAM detection（±s，ng/ml）

表3 特異性檢測結果（±s，ng/ml）Tab.3 Specificity for hMAM detection（±s，ng/ml）

Cross-reaction substances CEA（20 ng/ml）CA153（50 U/ml）Theoretical concentration 15 15 Measured concentration 14.69±0.85 14.82±1.18

2.4 方法學比對 如圖3所示，2種方法檢測血清中hMAM的相關方程為y=1.036x-0.079，R2=0.982 2，表明兩種方法相關性較好。

圖3 熒光免疫層析法與ELISA法的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between fluorescence

3 討論

乳腺癌是一種腫瘤細胞可以在早期擴散到血液和淋巴系統(tǒng)的全身性疾病，由于血液樣本相對容易獲得，對腫瘤的早期且準確的非侵入性檢測成為患者治療和預后的重要因素［7］。對于乳腺癌，CA15-3和CEA是常見的標志物，但缺乏敏感性和特異性，且很少在嚴重疾病中升高。雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2在臨床上是最有用的預后和治療指標，但對診斷和進展無顯著意義［8］。一種高靈敏度、高特異性的生物標志物對乳腺癌的正確診斷和預后評估至關重要［9］。hMAM是一種乳腺上皮細胞相關糖蛋白，在93%的乳腺癌中表達，血液中hMAM可在很早的階段被檢測到，且在早期乳腺癌中表達量最高［10-12］。有研究表明外周血中hMAM陽性與乳腺癌的診斷、監(jiān)測治療和臨床預后存在顯著相關性［13］。故建立hMAM快速檢測技術對疾病診斷治療具有重要意義。目前血清hMAM含量的檢測主要有RT-PCR、ELISA等方法，RT-PCR檢測靈敏性較高，但mRNA容易降解，操作較為復雜，而ELISA分析時間相對較長，不適合快速檢測［14-16］。熒光免疫層析法由于具有操作簡便、穩(wěn)定性好、價格低廉等優(yōu)點，成為近年來的研究熱點［17］。

本研究建立了一種銪螯合熒光納米微球免疫層析方法，采用時間分辨熒光技術利用波長和時間2個參數(shù)進行信號分辨，有效地排除非特異熒光的干擾，與傳統(tǒng)的快速檢測技術相比，該方法具有靈敏度高、定量檢測范圍廣等優(yōu)點。此外，本研究通過對熒光微球偶聯(lián)工藝的優(yōu)化，使得微球抗體偶聯(lián)較均一、熒光信號強、精密性、準確性均較好，與ELISA試劑盒同時檢測46例臨床樣本，相關性較好。綜上所述，本研究建立的hMAM熒光免疫層析檢測方法定量準確、簡便、快捷，可為基層醫(yī)院提供一種乳腺癌診斷和預后的輔助檢測手段，適合臨床推廣應用。