化肝纖方聯合恩替卡韋對慢乙肝肝纖維化患者的血清殼多糖酶3樣蛋白1及臨床療效觀察?

牙程玉，蔣銳沅，胡 曉，吳 聰，毛德文

(1. 廣西中醫藥大學，南寧 530001； 2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院,南寧 530023)

肝纖維化是各種病因導致的慢性肝臟疾病向肝硬化進展的中間病理過程，其臨床表現無特異性或差異較大，主要表現為肝區不適或脹或痛、疲倦乏力、食欲不振、大便異常等[1]。在我國，引起肝硬化及肝癌的主要原因是慢性乙型病毒性肝炎。據統計，全球肝硬化患者中，由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，HBV)引起的比例為60%[2]，而肝硬化轉變為肝癌的5年發生率為5%～30%[3]，因此抗肝纖維化在延緩疾病進展中起著至關重要的作用。有研究顯示，有效的病因治療可逆轉肝纖維化甚至早期肝硬化[4]。由此，肝纖維化的早發現、早診斷、早治療對肝病患者來說無疑意義非凡。

迄今，肝纖維化診斷的“金標準”仍是肝臟穿刺活檢，準確率可高達80%，但肝穿具有創傷性、患者難以接受、可重復率較低等問題，故臨床上難以普及。近年來研究者們發現，血清中存在一種大小約40kDa的分泌型蛋白殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)，它可用于檢測慢性乙肝患者的肝纖維化程度，并在肝臟中富集表達，比腎臟、心臟分別高出15.3、276倍[3]。有研究顯示，血清CHI3L1濃度隨肝纖維化的嚴重程度而逐步上升，并根據其表達水平可區分肝纖維化的不同階段[5]。筆者運用CHI3L1的這一特點，以CHI3L1作為主要血清學評價指標，觀察化肝纖方聯合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床療效。

肝纖維化屬于中醫學“脅痛”“積聚”等范疇，其中“痰濕”“瘀血”是形成肝纖維化的關鍵性病理產物[6]。廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病中心在肝纖維化治療方面具有獨到經驗，在對肝纖維化病因病機深入研究的基礎上研發了化肝纖方，該方是肝病中心積累多年經驗用于抗肝纖維化的基本方，全方以豁痰化瘀、軟堅散結為用，通過調整肝臟功能達到抗肝纖維化的目的。毛德文、胡振斌等通過觀察化肝纖方治療慢性乙型肝炎肝纖維化45例，表明化肝纖方在改善患者臨床癥狀、肝功能及抗肝纖維化方面均具有較好的臨床應用價值[7]。本研究已獲得廣西中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2018年12月廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病科收治入院治療的確診為慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者80例，以隨機數字表法將患者分為2組各40例。治療組40例，其中男21例，女19例,年齡36～59歲，平均年齡(48.2±8.4)歲。對照組40例，其中男23例，女17例，年齡35～63歲，平均年齡(48.3±6.2)歲。2組患者年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。2組患者均按時完成整個療程，無失訪與脫落病例。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 參照2015年由中華醫學會肝病學分會和中華醫學會感染病學分會共同制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[2]標準，參照2010年由中國中西醫結合協會肝病專業委員會制定的《肝纖維化中西醫結合診療指南》[1]標準。在慢性乙型肝炎的基礎上出現肝區不適或脹或痛、乏力、食欲不振等臨床癥狀；實驗室檢查：肝功能—丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)，兩者均≤2.5倍正常值；AST/血小板比值(AST to platelet ratio index，APRI)<2；肝纖4項、肝臟硬度值(liver stiffness measurement，LSM)均符合上述肝纖維化指南中的診斷。

1.2.2 中醫診斷標準 參照中國中西醫結合協會肝病專業委員會制定的《肝纖維化中西醫結合診療指南(2019版)》[8]中的標準：基本證型氣陰虛損、瘀血阻絡證，主癥為神疲乏力，肢體倦怠，脅肋、少腹刺痛或脹痛，納呆食少；次癥可兼有口干而苦，時有惡嘔、大便異常(便溏或大便干結)；舌脈：舌紫暗或有瘀斑瘀點，苔白或白膩，脈弦或弦澀。具備3項主癥或2項主癥伴隨1項次癥，同時結合舌脈，由兩名副主任及以上級別醫師判定。

1.3 納入標準

符合上述診斷標準，年齡在18～65周歲之間，性別不限；患者均未經任何抗肝纖維化治療，或既往接受過抗肝纖維化治療但需經過4周洗脫期；Fibrosis 4 Score(FIB-4指數)：[FIB-4指數=(年齡×AST)÷(血小板×ALT1/2)]在2-4級病人；ALT、AST≤2.5倍正常值；總膽紅素(Total bilirubin，TBiL)≤2.5倍正常值；乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus-DNA，HBV-DNA)≤9×104IU/mL；體質量指數(Body Mass Index，BMI)<28 kg/m2(BMI=體質量/身高的平方，單位kg/m2)；依從性良好，自愿接受本治療方案并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

不符合上述診斷及納入標準者；合并其他甲型、丙型、丁型、戊型等急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、肝衰竭等病史患者；合并其他器官及造血系統嚴重的原發或繼發疾病和精神病患者；合并艾滋病、結核病等嚴重傳染病者；妊娠期及哺乳期婦女。

2 方法

2.1 隨機原則

本研究采用單盲法將納入的80例患者按隨機數字表法分為治療組和對照組各40例，2組患者性別構成、年齡大小及病程長短等比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 治療方法

2組均給予一般西醫綜合治療、對癥處理及恩替卡韋分散片(正大天晴藥業集團股份有限公司生產，國藥準字H20100019)；治療組在對照組基礎上僅加用化肝纖方(由黃芪20 g、莪術15 g、丹參15 g、延胡索15 g、三七10 g、海藻10 g、昆布10 g、白芍15 g等組成)，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院煎藥室代煎，每袋150 mL，每日2次，1次150 mL，早晚飯后溫服，療程為8周。

2.3 觀察指標與檢測方法

分別于治療前、治療第4周末、治療后各采集患者清晨空腹靜脈血，3500 r/10 min離心分離血清，置于-70 ℃低溫冰箱中凍存待檢。

2.3.1 2組血清CHI3L1水平 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定，試劑盒購于浙江杭州普望生物技術有限公司，主要步驟：患者清晨空腹抽取靜脈血3 ml，于真空干燥抗凝采血管中靜置30 min后，3500 r/min離心機離心10 min，吸取上層血清。在96孔板中逐孔加入標準品和待測血清，并順序加入抗體、親和素與顯色劑，于37 ℃恒溫箱中充分孵育與反應，待反應完成后加入終止液，以酶標儀設置450 mm波長讀取OD值，以標準品構建標準曲線，換算每孔待測樣品中濃度值，嚴格按照說明書完成檢測。

2.3.2 2組肝功能(ALT、AST、TBiL) 采集患者清晨空腹靜脈血3 ml，離心取血清置于-70 ℃低溫冰箱中待檢；采用全自動生化分析儀(日立7600-020)測定ALT、AST、TBiL值，于治療前、治療第4周末、治療后各檢測1次。

2.3.3 2組肝纖4項 按上述方法收集患者血清，應用化學發光分析儀(邁瑞Mindray CL-2000i)，聯合化學發光法及相關檢測試劑，于治療前、治療第4周末、治療后各檢測1次透明質酸(HA)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)水平。

2.3.4 乙肝病毒DNA(HBV-DNA)轉陰率 使用相關試劑及PCR熒光法(上海宏石SLAN-96P)測定治療前、治療第4周末、治療后HBV-DNA水平；HBV-DNA≤102IU/mL為陰性。

2.3.5 肝臟硬度值(liver stiffness measurement，LSM) 患者于清晨空腹或進食后2 h，由操作次數≥500次的醫師對患者進行FibroScan無創肝纖維化掃描(FibroScan502超聲診斷儀：JX54700024)，于治療前、治療第4周末、治療后各檢測1次。

2.3.6 中醫癥狀評分 以中醫癥狀評分標準對2組患者自覺癥狀進行采集整理，參考《中藥新藥研究臨床指導原則》[9]中病毒性肝炎常見癥狀分級量化表的相關證候及中醫證候療效判定標準，選擇主要癥狀為神疲乏力、脅肋疼痛、食欲不振，次要癥狀包括口干而苦、惡心嘔吐、大便異常(便溏或大便干結)的輕重分級量表。癥狀按照嚴重程度分為無、輕、中、重4個級別，主要癥狀分別記為“0”“2”“4”“6”分；次要癥狀記為“0”“1”“2”“3”分。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 治療前后血清CHI3L1、肝纖4項水平變化比較

表1示，2組治療前后血清CHI3L1水平、肝纖4項比較。治療8周后，2組血清CHI3L1水平、肝纖4項均較治療前明顯下降(P<0.05)；治療組患者治療后血清CHI3L1及肝纖4項降低水平明顯低于對照組(P<0.05)。

表1 2組治療前后血清CHI3L1、肝纖4項比較

3.2 治療前后肝功能(ALT、AST、TBiL)、HBV-DNA變化水平

表2示，2組治療前后肝功能(ALT、AST、TBiL)、HBV-DNA水平比較。治療8周后，2組肝功能(ALT、AST、TBiL)及HBV-DNA均較治療前明顯下降(P<0.05)；治療組患者治療后肝功能(ALT、AST、TBiL)降低水平明顯低于對照組(P<0.05)；治療組治療后HBV-DNA與對照組對比，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 2組治療前后ALT、AST、TBiL、HBV-DNA比較

3.3 治療前后肝臟硬度值(LSM)、Fibrosis 4 Score(FIB-4指數)變化水平及FibroScan無創肝纖維化掃描圖

表3圖1示，2組治療前后LSM值、FIB-4指數比較，治療8周后，2組LSM值、FIB-4指數均較治療前明顯下降(P<0.05)，治療組患者治療后LSM值、FIB-4指數降低水平明顯低于對照組(P<0.05)。

表3 2組治療前后LSM值與FIB-4指數比較

注：圖1a為治療組患者治療前運用Fibroscan超聲掃描后，其肝臟硬度值(LSM)是8.7 kPa，四分位間距(Interquartile range，IQR)值為0.3，IQR/中值等于7%；圖1b為治療組患者治療8周后，LSM值是6.2 kPa，IQR值為0.7，IQR/中值等于11%。與治療前比較，患者肝臟硬度值下降2.5 kPa(IQR為10次檢測結果的四分位間距，IQR/中值指四分位間距除以中位數值)

3.4 2組中醫癥狀評分水平比較

表4示，2組治療前后中醫癥狀評分水平比較，治療8周后2組中醫癥狀評分較前明顯降低(P<0.05)，治療組治療后中醫癥狀評分明顯低于對照組(P<0.05)。

4 討論

慢性乙型病毒性肝炎仍是威脅人類生命健康安全的重要問題之一。據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染HBV，其中有2.4億為慢性HBV感染者[10]；我國是肝病大國，約有高達9300萬人為慢性HBV感染者，若不能有效控制病毒，則會逐漸演變成慢性肝炎，慢性肝炎經久不治，將逐步往肝纖維化、肝硬化、肝癌甚至肝衰竭等預后較差的疾病發展，而肝纖維化是在各種慢性肝炎基礎上向肝硬化轉變的重要中間環節。由此，積極控制、治療肝纖維化無疑成為延緩或截斷疾病進展的良好渠道。

肝纖維化是慢性肝病發生發展的中間病理性過程。在慢性肝病向肝纖維化演變進程中，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)起著至關重要的作用。肝臟損傷因子誘導并激活肝星狀細胞，其活化機制涵蓋多種炎癥因子及細胞通路，較為復雜，最經典的信號通路之一是TGFβ/Smad信號通路[11]，使肝星狀細胞轉變為肌成纖維細胞或成纖維細胞，從而導致肝細胞外基質(extracellular matrix，EMC)分泌增多，降解減少，促進慢性肝病向肝纖維化的轉化[12]。因此可以推斷，抑制靜息狀態的肝星狀細胞及促進活化的肝星狀細胞的凋亡，對肝纖維化的拮抗起到一定的促進作用，故肝纖維化的早發現、早診斷、早治療，將為慢性肝病患者保駕護航，提高患者生活質量及生存率。

表4 2組治療前后中醫癥狀評分比較(分，

肝纖維化診斷及分期的“金標準”是肝臟組織活檢，而這一有創的檢查技術不能廣泛地被患者接受，且可重復率低，在臨床普遍應用受到多方面限制，不利于推廣。由此，尋找新的可靠的無創肝纖維化血清學檢測指標或將成為國內外學者研究的重點方向。近年來，CHI3L1作為最新發現的蛋白，是殼多糖家族中的一員，雖然含有幾丁質結合結構域，但缺乏幾丁質酶活性，在炎癥及組織重塑中發揮著重要的關鍵性作用[13]。CHI3L1在肝臟中富集表達，且可在肝臟枯否細胞(kupffer cell，KC)中被誘導表達，從而激活肝星狀細胞，可能直接參與肝纖維化的生成和維持。CHI3L1的特質及大量臨床實驗數據表明，血清CHI3L1檢測可作為肝纖維化診斷及分期的重要臨床參考指標。在血清CHI3L1的診斷基礎上，聯合肝纖4項及FIB-4評分已構建的肝纖維化診斷框架，可顯著提高肝纖維化的診斷效能[14]，并將為肝纖維化患者提供又一簡便、快捷、無創的檢測方式，提高血清CHI3L1的臨床應用價值。

目前尚未有抗肝纖維化的特效西藥，而中西醫結合治療抗肝纖維化取得良好的治療效果[15]。肝纖維化屬于中醫學“脅痛”“積聚”等范疇。《素問·臟氣法時論篇》中說：“肝病者，兩脅下痛引少腹，令人善怒。”《素問·舉痛論篇》言：“寒氣客于厥陰之脈，厥陰之脈者，絡陰器，系于肝。寒氣客于脈中，則血泣脈急，故脅肋與少腹相引痛矣。”《靈樞·五邪》云：“邪在肝，則兩脅中痛，寒中，惡血在內。”《素問·刺熱論篇》中有：“肝熱病者，小便先黃……脅滿痛，手足燥，不能安臥。”《金匱翼·積聚統論》[16]中云：“凡憂思欲怒，久不得解者，多成此疾。”《景岳全書·痢疾論》[16]有：“飲食之滯，留蓄于中，或結聚成塊，或脹滿硬痛，不化不行，有所阻隔者，乃為之積。”《雜病源流犀燭·積聚癥瘕痃癖痞源流》[16]說：“壯盛之人，必無積聚。必其人正氣不足，邪氣留著，而后患此。”由此可歸納出，肝纖維化的病因病機無外人體正氣虛損，外邪、飲食、情志等因素內侵，導致氣、血、痰等凝聚于肝而成此病，臨床可見脅肋部疼痛、少腹疼痛、煩躁、不寐等表現。明·張介賓在《景岳全書·雜證謨》[16]中認為，積聚的治療“然欲總其要不過四法，曰攻曰消曰散曰補，四者而已”，又有“肝體陰而用陽”的特點。廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病中心在總結古籍、凝練肝纖維化病因病機的基礎上，潛心研制化肝纖方，該方以豁痰化瘀、調整臟腑陰陽為主，用藥忌剛宜柔，加用益氣健脾、養陰柔肝之品而成。方中的黃芪[17]、丹參[18]、三七[19]、莪術[20]等中藥經現代研究證實有減少肝內膠原沉積、改善肝臟微循環、促肝細胞再生和免疫調節等作用，可拮抗肝纖維化進程，改善肝纖維化患者臨床癥狀，提高患者的生存質量。

基于血清CHI3L1及其他相關肝纖維化評判指標的研究結果顯示，化肝纖方在抗肝纖維化方面具有良好的治療效果，能有效延緩肝纖維化的進展，甚至在一定程度上可逆轉肝纖維化，充分發揮了中醫藥在臨床有效治療慢性乙肝相關肝纖維化的作用，但研究者們仍然需要更進一步對化肝纖方抗肝纖維化的機制及分子層次進行研究探索，以更全面地評估化肝纖方的有效性及安全性，優化治療方案，為臨床廣泛應用與推廣中醫藥治療肝纖維化奠定更完善的前期研究基礎。