溫和灸對大鼠肌筋膜激痛點肌衛星細胞激活及成肌修復的影響?

林業武，曹 磊，陳美雄，高彥平，袁仕國△

(1. 海南省中醫院骨傷科, 海口 570203； 2. 海南省中醫院麻醉科, 海口 570203； 3. 南方醫科大學第三附屬醫院廣東省骨科研究院, 廣州 510630)

肌筋膜疼痛綜合征通常由急性和慢性骨骼肌損傷引起，超過3/4的世界人口都受其影響，是最重要和常被忽視導致運動功能障礙的原因[1]。肌筋膜激痛點(myofascial trigger point, MTrP)是骨骼肌中緊張的帶狀組織中的過敏結節，是診斷和治療肌筋膜疼痛綜合征的關鍵點[2]。骨骼肌在各種原因形成MTrP后，由于持續疼痛使功能障礙、廢用性萎縮，最終導致肌細胞萎縮、肌束纖維化，形成不可逆性病理改變。當肌肉出現嚴重纖維化時即表現為觸診中出現的條索和結節甚至發生鈣化。骨骼肌衛星細胞(skeletal muscle satellite cell, SMSC)又名成肌干細胞或骨骼肌干細胞，是骨骼肌損傷后修復的關鍵干細胞[3]。SMSC是骨骼肌組織內在的修復與維護系統，它通常是靜止的，但在肌肉損傷或劇烈運動后開始激活并增殖，可進入分化程序，與受損的肌纖維融合或形成新肌纖維，或重新恢復靜止的SMSC數量，或者分化為成纖維細胞等[4]。配對盒轉錄因子7(paired box gene 7, Pax7)是SMSC的標記性基因，對其活化、增殖、分化等均有重要影響。研究發現，靜止的SMSC為Pax7陽性，而激活后開始逐漸喪失，成肌分化后則消失[5]。Pax7陽性是保持SMSC自我復制的關鍵標志[6]。艾灸作為中醫的傳統瑰寶，在治療疼痛性疾病中發揮了巨大作用，并以其簡便驗廉優勢在各個科室大量使用[7]，而溫和灸是艾灸中最常用的方式。但艾灸治療肌筋膜疼痛綜合征作用機制缺乏研究。艾灸MTrP可促進局部炎癥因子消退和成肌修復[8-9]，但對SMSC增殖分化等影響尚不清楚。故本項目擬探索溫和灸對MTrP修復過程中成肌修復和SMSC的影響，旨在為溫和灸治療肌筋膜疼痛綜合征提供深入的理論支持。本研究已通過南方醫科大學實驗動物倫理委員會審查，動物飼養和操作等符合科學和動物倫理規范，同時接受南方醫科大學實驗動物倫理委員會監督。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，8周齡體質量(285.5±18.3)g，購自南方醫科大學醫學動物實驗中心，實驗動物許可證號SCXK(粵)20160041。溫和灸純艾絨艾條，北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司；XR-PT-10 A型動物實驗跑臺，上海欣軟信息科技有限公司。根據文獻自制打擊器，主要部分為長度50 cm的木棒，木棒頂端加有重物，木棒及重物總質量1200 g，下端為鈍頭錐形，打擊面積1 cm×1 cm，打擊高度20 cm，動能2.352 J；BX-53型光學顯微鏡，日本Olympus公司；Pax7抗體(Polyclonal,AF7584)由Affinity Bioscience公司、二抗(keyFluor 488標記山羊抗兔IgG (H+L)，KGAB010)由keyGEN bioTECH提供。

1.2 大鼠分組

30只SD大鼠均分入正常組、模型組和溫和灸組每組各10只。正常組不予任何干預，為空白對照組；模型組僅行MTrP造模；溫和灸組行MTrP造模+溫和灸干預。

1.3 大鼠干預

所有大鼠適應性飼養1 d然后開始造模干預。正常組常規飼養不予干預，模型組采用打擊結合離心運動的方法建立MTrP模型。造模方法：用 10%的水合氯醛按3 ml/kg行腹腔麻醉，固定大鼠后在大鼠右股內側肌中段偏近側端做一打擊位置標記，自制打擊器的錐形鈍頭從20 cm高處落下，造成打擊部位的骨骼肌損傷；第2天大鼠于傾角為-16°的電動跑臺上進行持續性下坡跑訓練，速度16 m/s，持續90 min，運動中使用聲音和機械刺激驅趕，每周進行打擊和跑臺運動1次，連續4周，然后第31～60天正常飼養不予干預(具體方法參見文獻[8, 10])。溫和灸組進行MTrP造模+艾灸干預。MTrP造模同模型組，然后每次打擊后第3天至第7天進行MTrP(打擊部位)溫和灸。操作如下：麻醉后固定，用定制的動物用細艾條(長20 cm,直徑7 mm)點燃后，正對大鼠打擊部位進行艾灸刺激30 min，將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚表面以監測實時溫度，通過調節艾條與施灸穴位的距離在4～5 cm左右[11]，將施灸局部皮膚溫度控制在(46 ℃±1℃)。MTrP打擊后第3～7天溫和灸，每日1次，連續5 d為1個療程，共4個療程。

1.4 MTrP取材及組織病理片制作

所有組別在第30天和第60天分別隨機取5只大鼠，然后10%的水合氯醛按6 ml/kg用量腹腔注射過量麻醉處死大鼠。按文獻方法取材，暴露股四頭肌，用拇指和食指指腹輕輕按壓探尋股四頭肌，查找股內側肌打擊部位及周圍的肌緊張帶，可觸摸及明顯的緊張帶和/或膨大的結節，并予以針灸針刺入此處，引出顫搐反應者即為MTrP[8]。正常組則在右側股內側肌相應的位置取材。標本以MTrP為中心，切取1 cm×1 cm×1 cm軟組織塊，用生理鹽水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟至水，常規HE染色，光鏡下觀察MTrP炎癥細胞浸潤、肌細胞扭曲、斷裂、壞死、收縮結節、纖維化修復等病理形態。每個標本隨機取5個切片，每個切片采集5個200倍視野圖片，使用Image J軟件分析肌細胞所占面積，最終取其均數。

1.5 MTrP組織中Pax7檢測

采用免疫熒光法檢測Pax7。上述石蠟切片脫蠟至水后采用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 7.4) 60 ℃熱抗原修復16 h，自然冷卻至室溫下。山羊血清37 ℃封閉15 min，滴加稀釋比為1∶100兔抗大鼠Pax7一抗，4 ℃孵育16 h，PBS洗后滴加稀釋比1∶200的keyFluor 488標記山羊抗兔二抗，4 ℃孵育1 h，其余常規操作。熒光顯微鏡下觀測Pax7熒光強度，每個標本隨機取5個切片，每個切片采集5個200倍視野圖片，采用Image J分析Pax7熒光強度。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

所有大鼠無死亡，模型組、溫和灸組大鼠無骨折、皮膚破潰、感染等。模型組2只、溫和灸組1只大鼠血腫稍重，自行緩解，不影響后續實驗。正常組較模型組、溫和灸組大鼠活躍多動，各組飲食正常。

2.2 骨骼肌組織病理形態變化

光鏡下觀察可見，正常組骨骼肌肌細胞第30天和第60天均呈規則的多邊形且排列正常，無壞死扭曲，間隙均衡，無明顯炎癥細胞浸潤(見圖1a、1b)。模型組在第30天可見肌細胞扭曲、萎縮、斷裂，呈類圓形和不規則形，可見收縮結節，大量炎癥細胞浸潤；第60天少量炎癥細胞浸潤，但肌細胞仍呈類圓形或不規則形且萎縮、扭曲，收縮結節明顯(見圖1c、1 d)。溫和灸組在第30天可見肌細胞扭曲、萎縮，細胞間隙增大，炎癥細胞浸潤，但均較模型組改善；第60天炎癥細胞浸潤已消失，肌細胞萎縮、扭曲明顯改善，呈大小不等的多邊形，少量收縮結節，肌細胞再生(見圖1e、1f)。

圖1 不同時間組別的骨骼肌HE染色

2.3 各組骨骼肌細胞面積比例

表1示，正常組在第30天和第60天骨骼肌細胞橫截面積占視野面積比例(百分比)顯著，差異無統計學意義(P<0.05)，模型組第30天和第60天比較差異有統計學意義(P<0.05)，即MTrP造模后肌細胞會持續萎縮。溫和灸組第60天骨骼肌細胞橫截面積較第30天大且差異顯著(P<0.05)，即溫和灸后MTrP局部肌細胞面積明顯增長，且存在長期效果。同時在第30天時正常組肌細胞百分比最大，模型組最小，溫和灸組處于中間，即溫和灸可有效預防MTrP 的肌細胞萎縮；第60天時仍是正常組肌細胞百分比最大，模型組最小，溫和灸組雖然肌細胞大部分恢復，但尚未達到正常。

表1 不同組別大鼠肌細胞橫截面積占視野面積的百分比

2.4 Pax7的免疫熒光檢測

圖2表2示，正常組在第30天和第60天的Pax7免疫熒光強度比較差異無統計學意義(P<0.05)。模型組在第30天和第60天Pax7比較差異有統計學意義(P<0.05)，即MTrP造模后Pax7持續低表達，第60天時SMSC的Pax7表達微弱。溫和灸組第30天和第60天比較差異顯著(P<0.05)，即溫和灸干預可使MTrP局部SMSC避免過度激活，保持適度的增殖，并補充消耗的SMSC 。

表2 各組Pax7熒光強度數值及比較

3 討論

肌筋膜疼痛綜合征廣泛見于全身多處，如咬肌、三角肌、斜方肌、背闊肌、骶棘肌、臀中肌等[12]，至少85%的人都會經歷肌筋膜疼痛。各個專科門診觀測到發病率差異較大，普通骨科門診為21 %，特殊疼痛中心可高達93 %[13]，而老年久坐的女性發病率最高[14]，由此導致的疼痛、功能障礙以及心理負擔均極為普遍。但是對肌筋膜疼痛綜合征的基礎研究卻較為缺乏，近年來鮮有進展，故對其病理機制與治療需要深入研究。

MTrP是肌筋膜疼痛綜合征的關鍵特征，目前的基礎研究及臨床診治主要以MTrP為出發點。但MTrP的精確機制仍不明確，盡管現在很多理論揭示外周傷害感受器和中樞敏化等是可能的原因之一[15]。乙酰膽堿增加并在運動終板釋放，這個在活動的MTrP上可以用肌電圖記錄到，但不能作為診斷的標準。增加的乙酰膽堿可導致局部持續的肌節縮短，產生收縮結節。該收縮結節隨后引起血管收縮和肌肉的相對缺血。血管活性物質和促炎物質，如前列腺素、緩激肽、血清素和組胺響應這種局部缺血而釋放，并使肌肉產生敏感性疼痛。這些物質還可以激活局部自主反應釋放更多乙酰膽堿，產生正反饋回路，形成惡性循環。導致MTrP相關異常性疼痛、血流改變、出汗異常、反應性充血以及豎毛反應等[14, 16]。MTrP局部存在炎癥因子的高表達[9, 17]，而炎癥對骨骼肌干細胞-SMSC存在較復雜的影響，能直接激活并促進SMSC分化[18]。持續的炎癥可導致惡性循環，誘發炎癥瀑布效應，最終導致SMSC局部的微環境/龕發生變化，SMSC可能無法保持自我復制，可能導致其過度激活并耗竭[19-20]。SMSC耗竭后損傷的肌細胞壞死、萎縮而得不到補償，同時在炎癥因子等作用下，肌束逐漸纖維化，收縮功能減弱或消失，同時導致局部疼痛，由此引發臨床癥狀和功能障礙。

由于肌筋膜疼痛綜合征發病機制缺乏研究，其治療尚未有突破。溫和灸作為中醫艾灸的代表，在治療運動系統等疼痛性疾病中廣泛應用[21]。但艾灸作用機制復雜，現代研究認為是熱、光、煙等刺激，多靶點、多途徑激發了機體自身的內源性調節系統，產生了內源性保護物質，進而發揮靶器官調節效應。MTrP局部存在炎癥狀態[17]，艾灸不僅可降低MTrP局部的炎癥因子，亦促進成肌修復[8-9]，也可降低如神經根等炎癥[22]。肌筋膜疼痛綜合征屬于中醫傷證范疇，氣滯血瘀為主要病機，而溫和灸具有良好的行氣活血、通絡止痛等作用，非常適合肌筋膜疼痛綜合征的治療。本實驗造模后HE染色顯示，造模理想，在大鼠上成功復制MTrP。實驗中為方便而有效的實施溫和灸，采用損傷局部即MTrP溫和灸治療。發現溫和灸后MTrP炎癥細胞浸潤明顯減輕，這可與以往研究相互印證。且溫和灸存在后繼療效，能明顯增加肌細胞面積，促進成肌修復。SMSC受到各種原因激活后開始增殖或分化，而增殖后的SMSC重新恢復靜止狀態，補充SMSC從而保持SMSC的干細胞干性，出現Pax7陽性表達[5]。造模組SMSC的Pax7表達量微弱，表示SMSC大量激活，然而在造模后1個月(第60天)Pax7表達量更微弱，意味著SMSC數量極少且已被過度消耗，趨于耗竭。HE染色發現，造模組在第30天和第60天時MTrP局部的肌細胞數量少且面積占比低，與Pax7的表達一致。研究發現，局部微環境對于SMSC保持干性和數量至關重要[3]，炎癥狀態下SMSC激活，且多分化成為成纖維細胞等，“炎癥瀑布”則導致SMSC無法實現增殖，最終趨于耗竭[23-24]。SMSC趨于耗竭后骨骼肌損傷將難以成肌修復，導致萎縮、纖維化并產生功能障礙等。本研究通過Pax7的檢測發現，溫和灸后可使MTrP局部的SMSC保持適度的自我復制，抑制其過度的激活，避免SMSC的過度消耗。這種效果在溫和灸停止后30 d仍存在，說明溫和灸具有良好的調控SMSC增殖、分化的作用。但溫和灸的進一步量效關系、具體信號機制等仍需要深入研究。

總之，本研究進行肌筋膜疼痛綜合征的大鼠模型造模，成功復制MTrP大鼠模型，并予以溫和灸干預MTrP組，發現溫和灸可促進MTrP局部的炎癥消退，抑制SMSC的過度激活，保護SMSC的適當自我復制，促進骨骼肌修復。