山藥多糖對LPS誘導的心肌H9C2細胞炎癥因子表達和細胞凋亡的影響及機制

邢 若 王 鵬 李興杰

（首都醫科大學附屬世紀壇醫院藥劑科，臨床合理用藥生物特征譜學評價北京市重點實驗室，北京100038）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌的致病部分，其侵入機體后，可以誘導組織炎癥、氧化應激，造成組織損傷，最終誘導疾病發生［1］。LPS誘導的心肌細胞損傷是常見的心血管系統疾病如膿毒癥心肌損傷發生機制之一［2］。LPS刺激后的心肌細胞凋亡水平增加、炎癥因子釋放水平增加、氧化應激水平升高［3］。山藥多糖提取自山藥，具有抗衰老、增加免疫力、抗氧化、降血糖等功效［4］。研究顯示，山藥多糖有改善心血管系統疾病的功效［5］。NF-κB是在人體內發揮多種生物學作用的調控因子，其激活后能夠誘導炎癥、氧化應激、細胞凋亡發生［6］。LPS刺激后的心肌細胞中NF-κB激活水平升高，并且下調NF-κB激活水平可以抑制心肌細胞損傷［7］。現階段山藥多糖在LPS誘導的心肌細胞損傷中的作用還不明確。本實驗以心肌H9C2細胞作為體外實驗對象，探討山藥多糖對LPS誘導心肌細胞炎癥因子表達、細胞凋亡和氧化應激的影響和機制，為山藥多糖治療心肌損傷的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌H9C2細胞購自通派（上海）生物科技有限公司；ROS檢測試劑盒、LDH檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；TNF-α含量檢測試劑盒、IL-6含量檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司；C-Caspase-3抗體、IκBα抗體購自美國Proteintech公司；p65抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；山藥多糖（純度：UV≥90%，SC9990-20 mg）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法測定山藥多糖對心肌細胞增殖活性影響 將心肌細胞接種至96孔板中，每孔3 000個細胞。細胞貼壁以后，更換為含有山藥多糖終濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g/L的細胞培養液培養，置于CO2培養箱內37℃孵育培養24 h后，將培養板取出，添加10μl的CCK-8，繼續培養2 h，檢測570 nm的OD值，以OD值表示細胞增殖活性。

1.2.2 細胞分組 心肌細胞分成Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組，LPS、CYPS-L、CYPSM、CYPS-H組細胞分別以含有25 mg/L的LPS細胞培養液培養，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組細胞分別在細胞培養液中添加終濃度為0.05、0.10、0.20 g/L的山藥多糖。Control組為空白對照細胞。以CCK-8法測定Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組細胞培養24 h后細胞增殖活性變化。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組細胞，用冰預冷以后的PBS溶液洗滌2次，然后在細胞內添加300μl的結合緩沖溶液，添加Annexin VFITC和PI染色液各5μl，避光反應15 min，上流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.2.4 ROS、SOD、MDA、LDH水平檢測 收集培養24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組細胞和培養液上清，分別使用ROS檢測試劑盒（熒光法）、SOD檢測試劑盒（黃嘌呤氧化法）、MDA檢測試劑盒（硫代巴比妥酸法）測定細胞中ROS、SOD、MDA水平，ROS結果以相對熒光表示，用LDH檢測試劑盒（二硝基苯肼法）測定培養液上清中LDH水平，步驟均同試劑盒說明書。

1.2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平 收集培養24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組細胞培養液上清，以TNF-α含量檢測試劑盒（ELISA法）、IL-6含量檢測試劑盒（ELISA法）測定TNF-α、IL-6水平，步驟同說明書。

1.2.6 Western blot檢測C-Caspase-3、p65、IκBα蛋白表達 收集培養24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組細胞，用1 ml的PBS洗滌細胞2次，然后添加RIPA裂解試劑，冰上裂解30 min，將裂解液轉移到離心管內，12 000 g、4℃離心20 min，放在-80℃保存。以BCA法測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，每個孔內添加20μg蛋白樣品，蛋白樣品在添加到上樣孔之前需要與等體積的2×Loading Buffer混合煮沸5 min。100 V電壓電泳，觀察溴酚藍進入到上層膠和下層膠之間時，調整電壓為120 V繼續電泳。設置100 V的電壓轉膜90 min。取出電轉后的PVDF膜，放在封閉液（5%牛血清白蛋白）內孵育1.5 h，然后將PVDF膜放在一抗（CCaspase-3抗體按照1：800稀釋，p65抗體按照1∶1 000稀釋，IκBα抗體按照1∶1 000稀釋）中，在4℃結合過夜，然后放在二抗（二抗按照1∶4 000稀釋）中，在室溫孵育1.5 h。ECL發光后，分析目的條帶和內參GAPDH的灰度值，以GAPDH作為內參，分析目的蛋白表達變化。

1.2.7 NF-κB信號激活劑對山藥多糖影響心肌細胞凋亡、氧化應激以及炎癥因子表達的作用 檢測心肌細胞以含有25 mg/L的LPS、0.10 g/L的山藥多糖、1μmol/L的NF-κB信號激活劑PMA處理，記為CYPS-M+PMA組，以CYPS-M組作為參照，利用上述1.2.1～1.2.7中方法檢測細胞增殖、凋亡和ROS、SOD、MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平及C-Caspase-3、p65、IκBα蛋白表達水平。

1.3 統計學分析 用SPSS21.0軟件分析數據，數據以±s表示，兩組數據間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 山藥多糖對心肌細胞增殖活性影響 與0 g/L山藥多糖處理相比，0.05、0.10、0.2 g/L的山藥多糖處理后的心肌細胞增殖活性無顯著性差異，0.40、0.80 g/L的山藥多糖處理后的心肌細胞增殖活性降低（表1）。因此，選擇0.05、0.10、0.20 g/L的山藥多糖處理心肌細胞。

2.2 山藥多糖對LPS誘導的心肌細胞凋亡影響與Control組比較，LPS組心肌細胞增殖活性降低，凋亡率升高，細胞中C-Caspase-3蛋白表達水平也升高。與LPS組比較，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組心肌細胞增殖活性依次升高，凋亡率依次降低，細胞中C-Caspase-3蛋白表達水平依次降低（圖1、表2）。山藥多糖抑制LPS條件下心肌細胞凋亡。

2.3 山藥多糖對LPS誘導的心肌細胞氧化應激影響 與Control組比較，LPS組心肌細胞中ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，培養液上清中LDH水平升高。與LPS組比較，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組心肌細胞中ROS和MDA水平依次降低，SOD水平依次升高，培養液上清中LDH水平依次降低（表3）。山藥多糖抑制LPS條件下心肌細胞氧化應激。

表1 山藥多糖對心肌細胞增殖活性影響（±s）Tab.1 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity of cardiomyocytes（±s）

表1 山藥多糖對心肌細胞增殖活性影響（±s）Tab.1 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity of cardiomyocytes（±s）

Note：Compared with 0 g/L，1）P＜0.05.

Proliferative activity（OD570 nm）0.51±0.06 0.53±0.05 0.50±0.04 0.52±0.06 0.41±0.031）0.35±0.041）20.870＜0.001 Concentration（g/L）0 0.05 0.10 0.20 0.40 0.80 F P

2.4 山藥多糖對LPS誘導的心肌細胞炎癥因子表達影響 與Control組比較，LPS組心肌細胞培養液上清中TNF-α、IL-6水平升高。與LPS組比較，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組心肌細胞培養液上清中TNF-α、IL-6水平依次降低（表4）。提示山藥多糖抑制LPS條件下心肌細胞炎癥因子表達。

圖1 山藥多糖對LPS誘導的心肌細胞凋亡和C-Caspase-3蛋白表達影響Fig.1 Effects of Yam polysaccharideon LPSinduced apoptosis and C-Caspase-3 protein expression in cardiomyocytes

表2 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞增殖活性、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平影響（±s）Tab.2 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytesunder LPScondition（±s）

表2 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞增殖活性、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平影響（±s）Tab.2 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytesunder LPScondition（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPSM，4）P＜0.05.

C-Caspase-3 protein（%）0.22±0.03 0.85±0.091）0.63±0.052）0.45±0.042）3）0.27±0.032）3）4）218.507＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P Proliferative activity（OD570 nm）0.53±0.07 0.28±0.031）0.35±0.032）0.43±0.042）3）0.52±0.052）3）4）48.625＜0.001 Apoptosis rate（%）6.32±0.51 36.75±4.111）25.01±2.362）12.47±1.142）3）9.33±0.852）3）4）292.287＜0.001

2.5 山藥多糖對LPS誘導的心肌細胞中NF-κB信號通路激活水平影響 與Control組比較，LPS組心肌細胞中p65蛋白水平升高，IκBα蛋白水平降低；與LPS組比較，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H組心肌細胞中p65蛋白水平依次降低，IκBα蛋白水平依次升高（圖2、表5）。山藥多糖抑制LPS條件下心肌細胞中NF-κB信號通路激活。

2.6 NF-κB信號激活劑對山藥多糖影響LPS條件下心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥因子表達作用 與CYPS-M組比較，CYPS-M+PMA組心肌細胞增殖活性降低，凋亡率和C-Caspase-3蛋白表達水平升高，細胞中ROS、MDA水平升高，SOD水平降低，培養液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平升高，p65蛋白表達水平升高，IκBα蛋白表達水平下降（圖3、表6）。

表3 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞ROS、SOD、MDA水平和培養液上清中LDH水平的影響（±s）Tab.3 Effects of Yam polysaccharide on ROS，SOD，MDA levels and LDH level in supernatant of cultured cardiomyocytes under LPScondition（±s）

表3 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞ROS、SOD、MDA水平和培養液上清中LDH水平的影響（±s）Tab.3 Effects of Yam polysaccharide on ROS，SOD，MDA levels and LDH level in supernatant of cultured cardiomyocytes under LPScondition（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPS-M，4）P＜0.05.

LDH（U/L）5.23±0.51 32.47±3.301）23.32±2.152）15.02±1.452）3）7.84±0.722）3）4）309.100＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P ROS 1.00±0.09 4.69±0.511）3.26±0.122）2.04±0.202）3）1.45±0.112）3）4）300.395＜0.001 MDA（nmol/mg）9.55±0.74 31.45±2.681）21.28±2.062）16.34±1.422）3）10.20±1.012）3）4）244.621＜0.001 SOD（U/mg）86.79±8.51 39.50±4.221）48.62±3.562）62.30±4.812）3）76.08±6.572）3）4）99.466＜0.001

表4 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞培養液上清中TNFα、IL-6水平的影響（±s，ng/L）Tab.4 Effects of Yam polysaccharide on TNF-αand IL-6 levels in supernatant of cardiomyocyte culture medium under LPScondition（±s，ng/L）

表4 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞培養液上清中TNFα、IL-6水平的影響（±s，ng/L）Tab.4 Effects of Yam polysaccharide on TNF-αand IL-6 levels in supernatant of cardiomyocyte culture medium under LPScondition（±s，ng/L）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPSM，4）P＜0.05.

IL-6 36.52±3.71 327.94±20.841）264.89±22.852）186.76±18.422）3）104.55±10.282）3）4）439.868＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P TNF-α 22.81±2.01 217.89±16.351）163.74±12.582）104.95±10.222）3）43.78±3.262）3）4）548.128＜0.001

圖2 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞中p65、IκBα蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Yam polysaccharide on p65 and IκBαprotein expression in cardiomyocytes under LPScondition

表5 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞p65、IκBα蛋白表達水平的影響（±s）Tab.5 Effects of yam polysaccharide on p65 and IκBα protein expression in cardiomyocytes under LPS condition（±s）

表5 山藥多糖對LPS條件下心肌細胞p65、IκBα蛋白表達水平的影響（±s）Tab.5 Effects of yam polysaccharide on p65 and IκBα protein expression in cardiomyocytes under LPS condition（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPSM，4）P＜0.05.

IκBα 1.03±0.11 0.23±0.041）0.43±0.062）0.68±0.072）3）1.06±0.102）3）4）185.772＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P p65 0.20±0.03 0.96±0.111）0.65±0.062）0.41±0.042）3）0.21±0.022）3）4）251.202＜0.001

圖3 NF-κB激活劑和山藥多糖對LPS條件下心肌細胞中p65、IκBα、C-Caspase-3蛋白表達影響Fig.3 Effects of NF-κB activator and yam polysaccharide on p65，IκBαand C-Caspase-3 protein expression in cardiomyocytes under LPScondition

表6 NF-κB激活劑和山藥多糖對LPS條件下心肌細胞增殖活性、凋亡率和細胞中ROS、SOD、MDA水平和培養液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平以及p65、IκBα、C-Caspase-3蛋白表達水平影響（±s）Tab.6 Effects of NF-κB activator and yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate，ROS，SOD，MDA levels in cardiomyocytes，LDH，TNF-α，IL-6 levels in culture medium supernatant and p65，IκBα，C-Caspase-3 protein expression levels in LPStreated cardiomyocytes（±s）

表6 NF-κB激活劑和山藥多糖對LPS條件下心肌細胞增殖活性、凋亡率和細胞中ROS、SOD、MDA水平和培養液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平以及p65、IκBα、C-Caspase-3蛋白表達水平影響（±s）Tab.6 Effects of NF-κB activator and yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate，ROS，SOD，MDA levels in cardiomyocytes，LDH，TNF-α，IL-6 levels in culture medium supernatant and p65，IκBα，C-Caspase-3 protein expression levels in LPStreated cardiomyocytes（±s）

Note：Compared with CYPS-M，1）P＜0.05.

Groups Proliferative activity（OD570 nm）Apoptosisrate（%）C-Caspase-3 ROS MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）LDH（U/L）TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）p65 IκBα CYPS-M CYPS-M+PMA 0.44±0.05 11.58±1.23 0.49±0.05 1.00±0.08 15.95±1.36 61.84±5.30 14.78±1.27 102.98±10.41 187.93±14.45 0.38±0.05 0.63±0.06 t P 0.30±0.041）6.559＜0.001 18.65±1.751）9.916＜0.001 0.87±0.061）14.596＜0.001 1.69±0.121）14.353＜0.001 24.01±0.201）17.590＜0.001 46.21±3.371）7.466＜0.001 25.75±2.361）12.280＜0.001 185.72±16.651）12.641＜0.001 236.20±20.591）5.575＜0.001 0.75±0.071）12.903＜0.001 0.35±0.051）10.755＜0.001

3 討論

山藥又稱為薯蕷，具有補腎、健脾、生津等作用，其既是一味中藥，又是一種食物［8］。山藥多糖是山藥中的主要活性成分，其由葡萄糖、甘露醇、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等組成，具有降低血糖、調節免疫、抗腫瘤、清除氧自由基等藥理學功能［9］。有研究發現，山藥多糖治療后的心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡水平降低，山藥多糖降低腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應激和炎癥因子釋放水平［5，10］。本實驗顯示，山藥多糖處理后的LPS條件下心肌細胞增殖活性升高，細胞凋亡率降低，提示山藥多糖抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡，山藥多糖具有保護心肌細胞損傷的作用。

研究顯示，LPS誘導心肌細胞炎癥和氧化應激等是其造成心肌細胞損傷的重要機制［11］。LPS刺激以后的心肌細胞中產生大量的ROS，ROS不能被SOD等抗氧化酶及時降解，導致ROS聚集在心肌細胞內，ROS不僅能夠激活Caspase凋亡反應，誘導細胞凋亡發生，還可以將細胞內的脂質過氧化，造成氧化損傷［12-13］。MDA是脂質過氧化的產物，也是氧化損傷的標志［14］。脂質是細胞膜的主要成分之一，其過氧化后造成細胞膜損傷，促使細胞內的LDH進入細胞外，因此，檢測培養液上清中LDH水平可以間接反映細胞損傷程度［15］。Caspase-3位于Caspase級聯反應的下游，其活化后被認為是細胞凋亡的標志［16］。LPS刺激誘導心肌細胞產生大量的TNF-α、IL-6等炎癥因子，這些炎癥因子也能夠誘導細胞凋亡發生，加重細胞損傷［17-19］。另外，過量的炎癥反應也可以促進細胞內ROS積累［20］。本次實驗結果顯示，山藥多糖處理后的LSP條件下心肌細胞中ROS、MDA水平降低，SOD水平升高，培養液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平降低，C-Caspase-3蛋白表達水平下降，提示山藥多糖減少心肌細胞釋放炎癥因子，減少氧化損傷。

本課題組還進一步探討了山藥多糖的作用機制，發現山藥多糖能夠降低LPS條件下心肌細胞中p65表達水平，提高IκBα表達水平。p65是NF-κB信號的關鍵亞單位，其表達水平高低與NF-κB信號激活水平正相關，NF-κB激活水平與氧化應激、炎癥等有關［21］。IκBα是NF-κB信號的重要組成部分，其表達升高后NF-κB激活水平下調［22］。研究顯示，LPS刺激以后的心肌細胞中NF-κB信號激活水平升高，并且抑制NF-κB信號可以降低LPS誘導的心肌細胞損傷［7，23］。本實驗以NF-κB信號激活劑處理心肌細胞，結果發現，NF-κB信號激活劑可以逆轉山藥多糖對LPS誘導的心肌細胞增殖、凋亡、炎癥因子釋放以及氧化應激相關指標的影響，說明山藥多糖作用機制與NF-κB信號有關。

綜上，山藥多糖有改善LPS誘導心肌損傷的作用，其可以抑制細胞凋亡、氧化應激和炎癥因子表達，機制與抑制NF-κB信號密切相關。本課題組會繼續深入探討山藥多糖通過何種靶向機制影響NFκB信號進而調控細胞凋亡、氧化應激和炎癥因子表達。本實驗結果為山藥多糖治療心肌損傷的應用提供了理論資料，為研究山藥多糖在心血管系統疾病中的作用和機制奠定了基礎。