濾泡輔助性T細胞（Tfh）和激活B細胞在帕金森病患者外周血中的水平及意義①

陰育紅 金 鑫 王國輝（佳木斯市中心醫院神經內科，佳木斯154002）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種神經系統變性疾病，臨床表現以靜止性震顫、肌強直、運動遲緩及姿勢反射障礙為主［1］。目前較多的研究證明PD的發病與免疫有關，表現為黑質中大量組織相容性糖蛋白小膠質細胞的表達［2-3］。而PD患者外周血中細胞免疫和體液免疫也存在異常，目前，PD中的免疫異常究竟是原發還是繼發尚不明確。細胞免疫中存在細胞毒類T細胞、B細胞、調節性T細胞等，在既往研究中已經發現輔助性T細胞亞群在PD外周血中水平異常，且與炎癥反應有關［4-5］。濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cells，Tfh）是一種新型輔助性T細胞亞群，在B細胞的增殖、分化中具有重要作用，而Tfh水平與自身免疫性疾病和免疫異常疾病有關。有研究報道在自身免疫性疾病中Tfh扮演重要的推手作用，尤其是強直型脊柱炎活動期存在高水平的Tfh［6-7］。本研究以PD免疫失調為根據，主要研究在PD患者外周血中Tfh的水平與相關的激動B細胞、細胞因子的表達水平，探究Tfh在PD發病進展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選擇2016年1月至2017年12月于我院神經內科就診并確診為PD的患者73例。入組標準：①符合2016版中國PD診斷標準［8］；②患者未患有感染性疾病，外周血生物指標檢查未見炎性指標異常；③患者自愿入組，依從性良好；④無神經系統疾病史。排除標準：①患者具有腦卒中、腦外傷、腦膜炎病史；②患者入院時具有感染性疾病，外周血生物指標檢查中炎性指標異常；③患者有癡呆伴記憶力、語言、行為障礙；④無法配合檢查和治療。在最終入組的73例中，包括男性45例，女性28例。年齡55～82歲，平均年齡（65.3±5.3）歲，病程1～8年。按照Hoehn-Yahr分期法分為Ⅰ期22例、Ⅱ期24例，Ⅲ期15例，Ⅳ期12例，Ⅴ期0例。選擇同期的健康志愿者20例（control組），其中男性12例，女性8例，年齡45～75歲，平均年齡（58.3±6.3）歲，身體情況良好。本研究通過我院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 人淋巴細胞分離液（上海華精生物高科有限公司）；FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-ICOS、PE-CD19、FITC-CD83流式抗體（美國eBio-Science公司）；BCA試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）；ELISA試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；TRIzol試劑（BioTeKe公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（Sinobio公司）。

1.2 方法

1.2.1 外周單個核細胞的提取所有受試患者及健康志愿者均禁食12 h后抽取肘靜脈外周血5 ml，置于EDTA抗凝管，1 h內提取單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。具體方法為：無菌條件下以1 500 r/min離心外周血15 min，棄去上層血清，在血細胞沉淀中加入生理鹽水15 ml，均勻吹打后加入10 ml人淋巴細胞分離液，300 r/min離心30 min，小心吸取中間的單個核細胞層，轉移至干凈無菌管，1 500 r/min離心10 min，PBS清洗2次后備用，待檢測。

1.2.2 單個核細胞內Tfh和激活B細胞比例的檢測 將得到的單個核細胞隨機分為2份，其中1份進行CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞檢測，在PBMC加入FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-ICOS的 流 式 抗體 各10μl，充分混合后，避光孵育20 min，加入流式洗滌液2 ml混勻后，PBS清洗2次后上機檢測；另1份PBMC檢測CD83+CD19+激活B細胞，加入PE-CD19、FITC-CD83的流式抗體避光孵育20 min后，加入裂解液混勻后避光15 min，PBS清洗2次后上機檢測。標本同時使用同型對照。

1.2.3 ELISA法檢測血清IL-21的表達 收集提取的單個核細胞血清，使用BCA試劑盒進行蛋白質定量，調整濃度后，參照ELISA試劑盒說明檢測。

1.2.4 RT-qPCR檢測PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平 收集PBMC細胞，PBS清洗2～3次后加入1 ml TRIzol試劑裂解15 min，加入三氯甲烷1 ml，低溫下12 000 r/min離心15 min，加入等體積異丙醇混合后，靜置10 min，低溫下12 000 r/min離心15 min后取沉淀，紫外分光光度計檢測RNA純度（吸光度0.8～1.0），按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書操作檢測Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA表達水平。引物序列見表1。

1.3 統計學處理 應用SPSS20.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內進一步兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBMC中Tfh和激活B細胞水平的檢測結果PD患者外周血中Tfh細胞比例［（3.20±0.41）%］和B細胞比例［（3.69±0.58）%］顯著高于健康人外周血［（1.02±0.18）%、（1.17±0.21）%，P=0.000，0.000，t=8.124，6.547 2］，且Tfh和B細胞比例具有相關性（r=0.638，P=0.000）。而PD患者Ⅰ期～Ⅳ期外 周 血 中Tfh的 比 例 為（1.35±0.52）%、（2.65±0.33）%、（4.52±0.62）%和（5.95±0.68）%，與健康人相比，差異具有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=4.125、6.854、10.334、13.142）；B細胞比例為（2.08±0.55）%、（3.18±0.23）%、（4.96±0.58）%和（6.03±0.66）%，與健康人相比，差異具有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=5.982、8.214、10.224、15.214）。結果見圖1、2。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

圖1 外周血PBMC中Tfh和激活B細胞Fig.1 Tfh and activated B cells in PBMC of peripheralblood

圖2 Tfh細胞和激活B細胞在PD分期中的水平Fig.2 Levels of Tfh cells and activated B cells in staging of PD

2.2 PD患者外周血中IL-21的表達水平 Control組外周血中IL-21水平為（12.52±2.11）pg/ml，PD組外周血中IL-21水平為（19.31±2.87）pg/ml，二者差異具有統計學意義（P=0.000，t=9.362）。而在PD分期中，IL-21的水平隨分期增高而增高，相比control組差 異 具 有 統 計 學 意 義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=6.542、8.241、11.346、15.213）。見圖3。

2.3 PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平 Control組外周血中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平分別為（0.18±0.03）、（0.23±0.05）、（0.20±0.04），低于PD患 者 外 周 血 的（0.36±0.06）、（0.48±0.05）、（0.51±0.08），差異具有統計學差異（P=0.000、0.000、0.000、t=8.357、9.134、12.521）。且隨著分期增高，Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平顯著增高。見圖4。

圖3 外周血中IL-21的表達水平Fig.3 Expression of IL-21 in peripheral blood

圖4 PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平Fig.4 mRNA levels of Bcl-6，IL-21 and IL-4 in PBMC

3 討論

PD是一種中腦黑質多巴胺（dopamine in substantia nigra，DA）能神經元進行性變性、缺失、死亡的疾病［9］。目前氧化應激損害、鈣離子細胞毒性作用及興奮性氨基酸毒性是DA能神經元凋亡的主要學說，也是導致PD的主要原因［10］。但這些學說還無法完全揭示DA能神經元的損害，可能還有其他因素參與，因此近年來PD與免疫的關系逐漸被揭示。T淋巴細胞是主要的細胞免疫功能細胞，多項研究發現，PD患者外周血中存在T淋巴細胞亞群的改變，其中CD4+CD25+T細胞比例下降，而記憶T細胞比例增高，且γδ+T細胞顯著增高。由于CD4+CD25+T細胞和γδ+T細胞對于免疫功能的調節具有重要作用，二者的比例失調可導致免疫功能的失調［11-12］。Tfh是一種負責輔助B細胞的CD4+T細胞亞群，可以特異性表達CD40、誘導性協同刺激分子（ICOS）、CXCR5、BCl-6，分泌IL-21，在刺激B細胞增殖、分化及免疫球蛋白的轉換過程中發揮重要作用［13-15］。有研究表明，IL-21的缺失可導致Tfh水平下調，IL-21是Tfh產生和功能執行的關鍵因子，通過直接作用Tfh或間接作用Bcl-6等調節Tfh的分化，IL-21還可通過上調CXCR5表達促進Tfh向B淋巴濾泡遷移，促進B細胞的激活和增殖［16］。根據現有研究報道，Tfh和自身免疫疾病密切相關。對AIRE的研究中發現，MG患者外周血中CXCR5+CD4+T細胞比例顯著增高，且與疾病嚴重程度相關，ICOS介導淋巴細胞共刺激對誘導體液免疫產生AchR和發生EAMG非常重要［17］。在系統性紅斑狼瘡的研究中發現，B細胞的活化依賴于Tfh的介導，其中ICOS途徑可增強Tfh的細胞功能，CXCL3和IL-21可作為促炎因子提高機體炎癥水平，尤其是活動期系統性紅斑狼瘡，其IL-21的水平顯著高于靜止期［18］。在炎癥性腸病的發病中發現，Tfh異常活化可導致大量的IL-21分泌，同時IL-21與受體結合可誘導外周血及黏膜固有淋巴層中大量促炎因子的釋放，IL-21還可通過Th1細胞反應調節腸黏膜組織單個淋巴細胞增殖，分泌高水平的炎癥因子［19］。現有的研究表明，Tfh在免疫性炎癥反應中發揮重要作用，其作用機制與B細胞的激活及IL-21的分泌有關。

本研究結果顯示，PD患者外周血中Tfh比例增高，且與正常人相比，差異具有統計學意義，Tfh的比例隨PD分期增高而增高，且具有統計學意義。IL-21作為Tfh分化及功能的關鍵細胞因子，同樣在PD中高表達，且與H-Y分期相關。Tfh介導的炎癥作用與B細胞的激活有關，從結果看，PD患者中激活B細胞的比例顯著高于健康人，而激活B細胞比例隨分期增高顯著增高，說明在PD患者中存在Tfh的過度增殖和B細胞的過度激活，IL-21在Tfh和B細胞的相互作用中起重要作用。