液相色譜-高分辨串聯質譜法檢測牛奶中A1和A2 β-酪蛋白

劉澤陽, 李 明, 吳佩澤, 寧 楊, 梁大鵬

(1．吉林大學 地下水資源與環境教育部重點實驗室, 新能源與環境學院, 長春 130012; 2. 中國計量科學研究院 化學計量與分析科學研究所, 北京 100029)

酪蛋白約占牛奶中蛋白含量的80%[1], 酪蛋白主要包括α，β和κ-酪蛋白, 其中β-酪蛋白約占40%[2]. 目前已發現超過10種β-酪蛋白的變體形式， 其中最主要的兩種是A1和A2β-酪蛋白(簡稱A1和A2蛋白)[3]. A1和A2蛋白唯一區別在于其一級結構的第67位氨基酸, A1蛋白為組氨酸(Histidine, H), A2蛋白為脯氨酸(Proline, P)[4]. 盡管兩種酪蛋白的差別微小, 但在人體內消化時會產生不同的生物活性肽[5]. A1蛋白產生的β-酪啡肽-7(BCM-7)可誘發多種疾病[6]， 而A2蛋白則不產生BCM-7[7]. 研究表明, 經常攝入A1蛋白的人群在Ⅰ型糖尿病[8]、 胃腸感染[9]和缺血性心臟病[10]中的發病率高于攝入A2蛋白的群體. 文獻[11]研究表明， 患自閉癥兒童尿液中的BCM-7含量明顯高于健康兒童, 且其BCM-7的濃度與病情嚴重程度正相關. 盡管關于BCM-7的危害尚存在爭論[12], 但攝入不同酪蛋白引起的不同結果已得到廣泛關注. 為區分酪蛋白, 本文將僅含有A2蛋白的牛奶標為“A2牛奶”, 以此為消費者提供針對性選擇. 因此, 開發一種區分牛奶中A1和A2蛋白的檢測方法具有重要意義.

檢測牛奶及乳制品中β-酪蛋白種類的方法較多, 如通過電泳法結合多元線性回歸(MLR)可初步判斷奶酪中的酪蛋白種類[13]， 尿素-聚丙烯酰胺電泳可區分牛奶中的A1和A2蛋白[14], 也可通過中紅外光譜法[15]或聚合酶鏈式反應[16]對牛奶中的蛋白質進行分析, 確定蛋白質的組成和含量. 近年來, 色譜和質譜技術的快速發展為各領域提供了高靈敏度、 高精度和高可靠性的檢測方法. 液相色譜可分離牛奶中不同的酪蛋白, 高分辨質譜在檢測完整蛋白質方面具有非常高的可靠性和靈敏度[17]. 但是不同酪蛋白間的差異很小, 它們通常具有相似的物理、 化學性質, 增大了液相色譜的分離難度. 因此, 通過對酪蛋白酶解產生的特征肽段確定β-酪蛋白種類是一種更可行的方法[18].

本文建立一種基于液相色譜-高分辨串聯質譜(LC-HRMS/MS)的檢測方法, 通過檢測特征肽段區分牛奶中的A1和A2蛋白. 先用等電點沉淀法提取牛奶中的酪蛋白, 經胰蛋白酶酶解后, 再采用LC-HRMS/MS對酶解產物進行分析. 考慮到A1和A2蛋白差異點在第67位氨基酸, 所以選擇酶解后的蛋白片段49～97作為特征肽段. 除色譜保留時間和一級質譜質荷比數據外, 通過誘導碰撞解離(CID)模式的二級質譜實驗對特征肽段進行分析, 提高了結果的可靠性. 為驗證方法的實用性, 對市售4種普通牛奶和2種A2牛奶進行檢測. 結果表明, 本文方法具有高可靠性、 高靈敏度等優點, 可為A2奶源篩選和A2乳制品的質量控制提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CR 21GⅢ型高速冷凍離心機(日本日立公司); FE20-K型pH計(美國Mettler Toledo公司); SI500型振蕩培養箱(英國Stuart公司); ME614S型電子分析天平(德國Sartorius公司); ME36S型電子分析天平(德國Sartorius公司); Milli-Q Integral 3型超純水儀(美國Fisher Scientific公司); 1250系列色譜儀(美國Thermo Fisher公司); Velos PRO型(LTQ)-Orbitrap高分辨串聯質譜儀(美國Thermo Fisher公司); C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 2.6 μm, 10 nm， 美國Phenomenex公司).

聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、 牛胰蛋白酶、 牛β-酪蛋白和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司; 氯化鈉(質量分數為99.99%)購自德國Suprapur公司; 三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自北京GPC生物科技有限公司; 鹽酸(GR)購自北京化工廠; 甲酸(體積分數為98%)購自瑞士Fluka公司； A1和A2特征肽標準品購自廣東賽百威信息科技有限公司. 牛奶樣品購自長春市某超市.

1.2 樣品預處理

取10 mL牛奶樣品, 加入40 mL的Tris-HCl溶液(50 mmol/L, pH = 8.5), 混勻, 60 ℃恒溫振蕩1 h. 取15 mL上述溶液, 加入15 mL NaCl溶液(0.5 mol/L, 含體積分數為0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚), 用甲酸溶液將其pH值調至4.6[19]后, 于4 ℃靜置過夜. 離心(4 ℃, 10 000 r/min, 15 min)分離出沉淀的酪蛋白. 用25 mL的Tris-HCl溶液再次溶解沉淀, 取500 μL復溶液加入100 μL胰蛋白酶(0.7 mg/mL), 加水定容至1 mL后, 加入330 μL乙腈. 37 ℃恒溫反應6 h, 用20 μL體積分數為10%的甲酸溶液終止酶解反應, 樣品離心(10 000 r/min, 10 min)后, 取上清液備用.

1.3 色譜-質譜條件

色譜. 流動相A: 體積分數0.1%的甲酸水溶液; 流動相B: 體積分數0.1%的甲酸乙腈溶液; 梯度洗脫程序： 50 min內將流動相B從5%線性提升至55%; 進樣體積: 10 μL; 流速: 0.3 mL/min.

質譜. 電噴霧電離(ESI)正離子模式; 電壓: +2 kV; 鞘氣： 10; 輔助氣： 2; 吹掃氣： 0; 毛細管溫度: 375 ℃; 軌道阱分辨率： 300 000; 質量范圍(m/z)： 150～2 000; CID碰撞能: 24 eV.

1.4 數據處理

質譜數據通過儀器配備的Xcalibur?軟件進行處理; A1和A2蛋白被胰蛋白酶酶解后產生的肽段序列由網站(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)提供的Peptide-Cutter工具進行計算; 利用網站(https://prospector2.ucsf.edu/prospector/cgibin/msform.cgi?-form=msproduct)提供的MS-Product程序計算特征肽段的一級質譜和CID產物離子的理論數據.

2 結果與討論

2.1 酪蛋白提取與酶解

為充分溶解蛋白質, 通常用尿素和二硫蘇糖醇等搭配無機鹽配制緩沖溶液[20], 有助于展開蛋白質空間結構, 從而提高蛋白質提取和酶解效率. 為避免污染檢測器, 含有這類緩沖液的樣品在液相色譜-質譜(LC-MS)分析前需進行脫鹽處理. 但脫鹽處理操作繁瑣, 耗時長且容易導致樣品損失, 因此本文開發了一種不引入鹽雜質的蛋白質提取和酶解方法. 采用Tris-HCl水溶液提取酪蛋白, 在充分沉淀后經低溫離心分離酪蛋白. 低溫離心可減少乳蛋白中疏水基之間的相互作用, 防止乳清蛋白和酪蛋白聚集[21]. 但在酶解實驗中,β-酪蛋白標準品和牛奶樣品中提取的酪蛋白均未展現良好的酶解效果, 這是由于溶液中的酪蛋白處于折疊結構所致. 因此, 在酶解體系中加入可使蛋白質變性的乙腈試劑[22]. 添加乙腈顯著提高了酶解效率, 同時乙腈作為液相色譜分離中的流動相B, 無需在質譜檢測前進行去除. 經優化, 最終確定體積分數為25%的乙腈對酶解效率提升最明顯.

2.2 液相色譜分離與質譜全掃描

使用A1和A2特征肽混合標準品溶液(15 μg/mL)優化梯度洗脫程序. 由于胰蛋白酶特異性切割蛋白質中碳端的賴氨酸和精氨酸殘基[23], 因此選擇包含第67位氨基酸殘基的蛋白片段49～97作為區分A1和A2蛋白的特征肽段. 研究表明, 核殼結構填料的C18色譜柱對相似結構的多肽分離效果優異[24], 因此用其對A1和A2蛋白酶解后的特征肽段進行分離， 結果如圖1所示. 由圖1可見, 經優化后, A1和A2蛋白的特征肽段可完全分離. 分離后的肽段進入高分辨質譜進行全掃描分析, 結果如圖2所示.

在一級質譜圖中, A1和A2蛋白的特征肽具有不同的帶電荷情況, 其中四電荷A1特征肽離子(核質比(m/z)： 1 340.72)和三電荷A2特征肽離子(m/z： 1 773.95)的信號最強, 特征肽段帶電荷存在差異是由于二者的氨基酸組成不同所致[25], 即A1特征肽比A2特征肽多一個堿性氨基酸殘基(67位組氨酸). 2條特征肽段檢測到的分子量數據與理論數據(https://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm)一致, 質量偏差均小于4×10-6. A1和A2特征肽段的相關信息列于表1.

2.3 牛奶中A1和A2蛋白的測定

為驗證該方法的實用性, 選取市售的4種普通牛奶和2種A2牛奶進行分析, 編號1～4為普通牛奶， 5,6為A2牛奶.

采用LC-HRMS/MS方法, 通過A1和A2特征肽的色譜保留時間和一級質譜數據可確定β-酪蛋白的變體形式. 若樣品中存在保留時間相近且相對分子質量相似的雜質, 則會產生不易分辨的干擾信號. 用串聯質譜的二級質譜模式對其優化, 可提高檢測結果的可靠性. 將特征肽進行串聯質譜CID分析, 對碎片離子信息進行解析和標注, 結果如圖3所示. 由圖3可見， 碎片離子與理論數據吻合.

圖1 A1和A2特征肽混合標準品溶液(15 μg/mL)中A1特征肽(A)和A2特征肽(B)的提取離子色譜

圖2 分離后肽段的高分辨質譜

表1 A1和A2特征肽段的相關信息

圖3 牛奶樣品中A1(A)和A2(B)特征肽的CID譜

相比于一級質譜, 從二級質譜中得到的提取離子色譜(EIC)可排除樣品中可能存在的具有相似保留時間和質量的雜質, 進一步提高了分析方法的可靠性和準確性. 在二級質譜中, 碎片離子y13是2種特征肽碎裂后信號最強的碎片離子, 所以選擇該信號構建A1和A2特征肽的EIC, 結果如圖4所示. 牛奶樣品中A1和A2蛋白的相對含量如圖5所示. 由圖5可見： 在1～4號牛奶樣品中可同時檢測到A1和A2特征肽, 根據峰面積半定量分析, 普通牛奶中A1蛋白約為A2蛋白含量的2～4倍； 5號牛奶樣品中僅存在A2特征肽信號; 6號牛奶樣品中出現強度較小的A1特征肽信號, 其信號強度明顯低于其本身的A2特征肽信號, 表明該樣品中存在少量A1β-酪蛋白, 可能是由于篩選A2奶源所用的分析方法靈敏度較低所致.

圖4 牛奶樣品A1和A2特征肽的提取離子色譜(提取二級質譜中的最強信號m/z： 1 428.92)

圖5 牛奶樣品中A1和A2 β-酪蛋白相對含量示意圖

綜上所述， 本文建立了一種基于液相色譜-高分辨串聯質譜方法, 通過檢測蛋白被酶解后的特征肽段測定牛奶中的A1和A2蛋白. 在蛋白提取和酶解的樣品處理中, 采用Tris-HCl作為緩沖液, 乙腈作為蛋白變性劑, 簡化了實驗操作, 縮短了實驗時間. 利用檢測特征肽段實現了A1 和A2β-酪蛋白的鑒別, 避免了完整蛋白質分析法中色譜分離難等缺點. 通過液相保留時間、 高分辨一級質譜和串聯質譜分析, 進一步排除了可能產生的干擾信號, 提高了方法的可靠性. 通過對市售6種牛奶的分析, 該方法具有較高的穩定性和靈敏性, 可幫助企業開發A2產品和服務政府部門進行質量監管.