電化學法檢測細胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶

張樹萌， 李錦蓮， 郭曉玲， 孟令仁， 周 實

(佳木斯大學 藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

胸腺嘧啶和胞嘧啶是兩種重要的嘧啶分子， 存在于脫氧核糖核酸(DNA)中并參與細胞嘧啶核苷酸的代謝， 可調控血流、 預防心律失常、 抑制神經遞質釋放并調節腺苷酸環化酶活性[1-2]. 胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量是診斷癌癥、 艾滋病、 心肌細胞能量狀態、 疾病治療進展評價的重要參數[3-4]. 由于核苷酸、 核苷及其堿基的定量檢測在生物醫學、 生理學和臨床研究領域應用廣泛， 因此測定胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量或它們在DNA中的比例已引起人們廣泛關注[5]. 生物樣品中胸腺嘧啶和胞嘧啶定量分析的常用方法有高效液相色譜法(HPLC)[6]、 質譜法(MS)[7]、 凝膠電泳法[8]等. 但在實際應用中存在樣品前處理復雜、 儀器昂貴、 不便攜帶、 需要衍生或需結合其他檢測方法等問題. 電化學分析法[9-13]具有較高的靈敏度、 重現性、 簡便性、 樣品前處理簡單、 成本低、 可實時檢測等優點. 其中， 基于嘌呤核苷酸代謝的細胞電化學法已用于評價環境雌激素效應、 檢測典型環境污染物(重金屬、 氯酚類)的細胞毒性等[14-15].

文獻[16]制備了氧化石墨烯量子點/多壁碳納米管修飾的絲網印刷電極(GOQDs/MWCNTs/SPCE*)， 構建微型反應裝置， 在較寬的電位窗下實現了尿酸與嘌呤的同時檢測. 本文利用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的電化學檢測方法對胸腺嘧啶和胞嘧啶標準品進行同時檢測， 考察最佳檢測條件， 研究電極對兩種嘧啶分子的選擇性和靈敏度， 實現電化學法同時測定小鼠胚胎成纖維(BALB/c 3T3)細胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶， 為嘧啶分子的靈敏快速檢測提供新技術方法.

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

小鼠胚胎成纖維細胞(BALB/c 3T3， 中科院上海細胞庫); DMEM培養基(Dulbecco’s modified eagle medium， 美國Gibco公司); 氧化石墨烯量子點(GOQDs， 南京先豐納米材料科技有限公司); 高純多壁碳納米管(MWCNTs， 深圳納米港有限公司); 尿酸(UA)， 黃嘌呤(X)， 鳥嘌呤(G)， 腺嘌呤(A)， 次黃嘌呤(HX)， 胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)均購自美國Sigma公司; 其他試劑均為國產分析純試劑.

恒電位儀(CHI 660型， 上海辰華儀器有限公司); 絲網印刷電極(SPCE， SE100型， 臺灣地區Zensor R&D公司); 高效液相色譜儀系統(G1311Agilent 1100型， 德國安捷倫科技有限公司); 二氧化碳恒溫培養箱(311型， 美國Thermo公司); 倒置熒光顯微鏡(CKX41型， 日本Olympus公司); 培養皿(D8054型， 美國Sigma公司); 培養板(3603型， 美國Corning公司); 超潔凈工作臺(VS-1300U型， 蘇州華宇凈化設備有限公司).

1.2 細胞培養與收集

細胞在含10%胎牛血清、 1% 100 μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中于37 ℃、 φ(CO2)=5%的細胞培養箱中培養. 除去培養皿中的培養基， 加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS)于水浴鍋中, 50 ℃裂解后進行電化學檢測[8].

1.3 電化學檢測方法

GOQDs/MWCNTs/SPCE*的制備過程參照文獻[16]， 在電化學分析儀上， 用微分脈沖伏安(DPV)法于25 ℃進行電化學檢測， 三電極體系包括GOQDs/MWCNTs/SPCE*工作電極， Ag/AgCl/KClsat參比電極和鉑絲對電極.

1.4 高效液相色譜檢測

檢測條件： Ascenis RP-Amide型色譜柱(4.0 mm × 250 mm × 5.0 μm); 檢測波長： 254 nm; 柱溫： 25 ℃; 流動相： 0.02 mmol/L pH=4.9的KH2PO4溶液; 流動相流速： 1.0 mL/min; 進樣量： 20 μL. 樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣檢測.

1.5 數據處理與分析

用Origin 2018軟件繪圖.

2 結果與討論

2.1 胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學行為

用已構建的電化學檢測系統[16]對胸腺嘧啶(50 μmol/L)和胞嘧啶(100 μmol/L)標準品進行檢測， 兩種混合物在不同電極上的DPV曲線如圖1所示. 對比5個電極， GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極在1.15，1.30 V處有2個明顯的電化學信號， 分別歸屬于胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰. 由圖1可見， GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極對胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學響應較強.

2.2 富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學信號的影響

富集電位、 富集時間和pH值等因素均影響電極對樣品的檢測效率. 為研究富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶在GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極上電化學行為的影響， 在不同富集電位(-0.3，-0.2，0，0.2，0.3 V)下測定胸腺嘧啶和胞嘧啶標準樣品的電化學信號， 富集時間為360 s， 結果如圖2所示. 由圖2可見， 富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電流影響較小. 因此， 選取0為最佳富集電位.

圖1 胸腺嘧啶和胞嘧啶混合物在不同電極上的DPV曲線

圖2 富集電位對胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電流的影響

2.3 富集時間對胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學信號的影響

圖3 富集時間對胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電流的影響

圖3為不同富集時間下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)標準樣品的電化學曲線， 富集時間分別為0,90,150,240,300 s. 由圖3可見， 隨著富集時間的增加， 氧化峰電流小幅度增加， 150 s后峰電流隨富集時間的增加基本無變化. 這可能是富集150 s時， 樣品在電極表面上的吸附達到了飽和狀態， 因此選取150 s為最佳富集時間.

2.4 pH值對胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學信號的影響

圖4為不同pH值(5.90，6.58，7.40，8.66，9.50，10.55)下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)的氧化峰電位和氧化峰電流的變化. 由圖4(A)可見， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電位隨pH值的增加而負移， 表明質子參與了電化學反應[14]. pH值與峰電位呈一定的線性關系， 線性方程分別為

ET= 1.509 9-0.049 0pH (R2= 0.990 8)，

EC= 1.534 7-0.034 6pH (R2=0.990 6).

兩個方程的斜率值分別為0.049 0，0.034 6， 與理論值0.059，0.029接近， 表明胸腺嘧啶和胞嘧啶在電極表面分別發生了兩電子和單電子的氧化反應[15]. 由圖4(B)可見， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的峰電流隨pH值的減小而增加， 當pH=7.4時， 電極對胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學響應較強， 且細胞的生理pH=7.4， 因此選取pH=7.4為檢測條件.

2.5 GOQDs/MWCNTs/SPCE*的選擇性和靈敏度

為考察基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的檢測系統對胸腺嘧啶和胞嘧啶混合溶液的選擇性， 在最佳檢測條件下， 通過改變一種物質濃度而另一種物質濃度保持不變繪制電化學曲線， 結果如圖5所示. 由圖5可見， 隨著待測物質濃度的增加， 其氧化峰電流增加， 而濃度保持不變的另一種物質的電化學信號沒有變化. 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的微檢測系統可靈敏檢測到胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學信號的變化， 分別在5～340 μmol/L和5～430 μmol/L內， 兩種物質的濃度與氧化峰電流呈良好的線性關系. 對應的線性方程分別為

IT=17.138 0+0.157 9c(R2=0.996 8)，

IC=34.749 2+0.135 18c(R2=0.998 6)，

且最低檢測限分別為0.69，0.95 μmol/L.

圖4 pH值對胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電位(A)及氧化峰電流(B)的影響

(A) a～l: c(T)=5,25,50,85,110,140,185,220,240,270,310,340 μmol/L; (C) a～m: c(C)=5，25，50，75，100，120，180，230，280，320，360，390，430 μmol/L.

2.6 細胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的檢測

高效液相色譜(HPLC)法常用于定量檢測生物小分子[7]. 將BALB/c 3T3細胞懸浮液及加入尿酸、 黃嘌呤、 鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶的細胞懸浮液用HPLC法進行對比， 結果如圖6所示， 其中測試細胞的濃度為每毫升106個細胞. 由圖6可見， 胞嘧啶和胸腺嘧啶的保留時間分別為4.20，13.32 min. 利用內標法檢測加入的7種標準品， 只有6個信號發生變化. 原因是細胞中還存在大量嘌呤， 胸腺嘧啶與黃嘌呤的出峰位置接近且無法分離(圖6(B))， 因此用HPLC法無法同時檢測到BALB/c 3T3細胞中胞嘧啶和胸腺嘧啶的出峰位置， 僅能檢測到胞嘧啶.

紅線： BALB/c 3T3細胞懸浮液; 黑線： 細胞懸浮液和尿酸、 黃嘌呤、 鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶混合物.

用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的細胞電化學法對BALB/c 3T3細胞樣品進行檢測， 結果如圖7所示. 由圖7可見， 在細胞裂解液中檢測到位于0.28，0.65，0.92，0.97 V處存在4個電化學信號[17-18]. 與尿酸和嘌呤標準樣品對比， 4個電化學信號分別歸屬于細胞中尿酸、 黃嘌呤/鳥嘌呤、 腺嘌呤和次黃嘌呤的氧化. 細胞裂解液中檢測到位于1.15，1.30 V處的2個電化學信號歸屬于細胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化. 可見， 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的細胞電化學法可實現細胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同時檢測.

紅線： BALB/c 3T3細胞； 黑線： 尿酸、 黃嘌呤/鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶標準品混合物.

綜上所述， 本文用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的電化學檢測方法考察了富集電位、 富集時間、 pH值等因素對胸腺嘧啶和胞嘧啶標準品電化學行為的影響， 獲得最佳檢測條件為富集電位0， 富集時間150 s， pH=7.4; 電極對胸腺嘧啶和胞嘧啶的最低檢測限分別為0.69，0.95 μmol/L. 該方法實現了BALB/c 3T3細胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同時靈敏檢測， 為生物樣品中嘧啶分子的靈敏快速檢測提供了一種新技術方法.