黑果腺肋花楸有效物質的提取及抗氧化和降糖活性研究

張家豪，馬 芹

(1.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000； 2.新疆華世丹藥物研究有限責任公司，新疆 烏魯木齊 830011)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，又稱野櫻莓、不老莓，是薔薇科腺肋花楸屬植物[1]。黑果腺肋花楸的果實呈球形，果肉為黑色，果汁為暗紅色，口味酸甜，具有較強的耐寒性，喜濕潤和透氣性良好的土壤，能在-45 ℃的寒冷環境下生存，是集食用、藥用、園林和生態價值于一身的喜陽耐寒落葉灌木[2]。原產自美國東北部[3]，上世紀90年代引種至我國，先后引進了8個品種[4]。

黑果腺肋花楸中最重要活性成分是多酚類化合物，包括高濃度的花色苷、黃酮類化合物、原花青素及酚酸等，具有較強的抗氧化活性[5-6]。研究[7]表明，黑果腺肋花楸中多酚類化合物含量達到2.5%～3.5%，約是藍莓的5倍、越橘的15倍、黑莓的10倍、覆盆子的20倍以及葡萄的80倍。此外，黑果腺肋花楸中黃酮類化合物含量(高達0.25%～0.35%)豐富[8-9]，是已知植物中含量最高的。歐美和東亞一些國家以黑果腺肋花楸為原料生產的食品、藥品、化妝品、保健品等產品十分豐富，相關產業已建立完善，取得了可觀的經濟效益。盡管如此，國內對于黑果腺肋花楸的利用主要體現在園林綠化方面，對其果實加工及在食品和藥品等方面的開發研究還處于起步階段[10]。鑒于此，作者建立了黑果腺肋花楸多酚和黃酮的超聲輔助提取法，采用單因素實驗和正交實驗并通過多指標綜合評分法優化提取工藝；通過對DPPH的清除能力評價其抗氧化活性；并通過建立肝細胞高糖損傷模型，比較提取物組與模型組葡萄糖消耗量評價其降糖活性，為黑果腺肋花楸保健品的進一步開發利用提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

黑果腺肋花楸(批號：20180606、20180706、20180806)，產自新疆塔城裕民縣；人肝LO2細胞系，購于上海細胞典藏中心。

沒食子酸標準品(110831-200803)、蘆丁標準品(110742-201622)，中國食品藥品研究院；維生素C(191202)，四川依科制藥有限公司；GLU葡萄糖檢測試劑盒(20191207137)，南京建成生物工程研究所；其它試劑，市售。

KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；TD2002型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；2323-2型CO2細胞培養箱，美國謝爾登公司；Model-680型酶標儀，BIO-RAD公司。

1.2 黑果腺肋花楸有效物質的提取

稱取一定量黑果腺肋花楸，按一定液料比加入一定體積分數的乙醇打漿，在一定超聲功率下提取一定時間，除去濾渣及乙醇，得黑果腺肋花楸提取液。將提取液揮去大部分水分得浸膏，然后置于真空干燥箱中烘干得干膏，稱重。出膏率=(干膏質量/黑果腺肋花楸質量)×100%。

采用單因素實驗和正交實驗優化提取工藝。

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 乙醇體積分數的影響

精確稱取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1(mL∶g，下同)加入體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇打漿，在超聲功率180 W下提取50 min，提取溫度為50 ℃，除去濾渣及乙醇后，測定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察乙醇體積分數對多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響。

1.2.1.2 超聲功率的影響

精確稱取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1加入60%乙醇打漿，在超聲功率分別為80 W、100 W、120 W、140 W、160 W、180 W、200 W下提取50 min，提取溫度為50 ℃，除去濾渣及乙醇后，測定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察超聲功率對多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響。

1.2.1.3 提取溫度的影響

精確稱取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1加入60%乙醇打漿，在超聲功率180 W下提取50 min，提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，除去濾渣及乙醇后，測定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察提取溫度對多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響。

1.2.1.4 提取時間的影響

精確稱取一定量黑果腺肋花楸，按液料比20∶1加入60%乙醇打漿，在超聲功率180 W下分別提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，提取溫度為50 ℃，除去濾渣及乙醇后，測定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察提取時間對多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響。

1.2.1.5 液料比的影響

精確稱取一定量黑果腺肋花楸，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入60%乙醇打漿，在超聲功率180 W下提取50 min，提取溫度為50 ℃，除去濾渣及乙醇后，測定黑果腺肋花楸提取液的吸光度值，考察液料比對多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響。

1.2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選取超聲功率、提取時間、乙醇體積分數、液料比為考察因素，以多酚含量、黃酮含量和出膏率為考察指標，進行L9(34)正交實驗，采用多指標綜合評分法對實驗結果進行分析，優化提取工藝。

1.3 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法(福林酚試劑法)，以沒食子酸為標準品，參考GB/T 8313-2008[11]方法繪制沒食子酸的標準曲線。精確稱量適量沒食子酸，加蒸餾水配制成1.0 mg·mL-1的沒食子酸儲備液。準確吸取2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL沒食子酸儲備液，分別置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得到濃度(μg·mL-1)分別為20、30、40、50、60 的沒食子酸標準溶液。分別取1 mL各濃度沒食子酸標準溶液置于10 mL容量瓶中，加入1 mL 50%福林酚試劑、3 mL 7.5%碳酸鈉溶液、5 mL蒸餾水，避光顯色2 h后，測定其在765 nm處吸光度值。以沒食子酸濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制沒食子酸標準曲線，擬合得線性回歸方程。

準確吸取1 mL黑果腺肋花楸提取液，按上述方法測定765 nm處吸光度值，根據回歸方程計算多酚濃度，按式(1)計算提取液中多酚含量(mg·g-1)：

(1)

式中：c為提取液中多酚濃度，mg·mL-1；V為待測提取液體積，mL；n為提取液的稀釋倍數；m為黑果腺肋花楸質量，g。

1.4 黃酮含量的測定[12]

精確稱取適量105 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品，加甲醇溶解并定容，配制成150 μg·mL-1的蘆丁標準溶液。準確移取蘆丁標準溶液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇至5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后靜置5 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，振搖后靜置6 min；再加入4.3%氫氧化鈉溶液2 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，測定其在510 nm處吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，擬合得線性回歸方程。

準確吸取1 mL黑果腺肋花楸提取液，按上述方法測定510 nm處吸光度值，根據回歸方程計算黃酮濃度，按式(2)計算提取液中黃酮含量(mg·g-1)：

(2)

式中：m1為根據標準曲線計算出的待測液中黃酮量，μg；m為黑果腺肋花楸質量，g；V1為待測液體積，mL；V2為提取液總體積，mL。

1.5 抗氧化活性評價

稱取一定量DPPH溶于無水乙醇中，配制成100 μg·mL-1的DPPH母液，置于遮光瓶中，-20 ℃下保存。將DPPH母液稀釋至50 μg·mL-1[13]，于96孔板中每孔加入100 μL，然后按濃度梯度加入100 μL VC溶液或100 μL黑果腺肋花楸提取液；置于37 ℃烘箱中避光反應30 min，用酶標儀測定490 nm處吸光度值，并計算IC50值。

1.6 降糖活性評價

1.6.1 黑果腺肋花楸提取物溶液的配制

將黑果腺肋花楸干膏溶于4% DMSO溶液中，配制成5 mg· mL-1的母液A；用4% DMSO溶液稀釋得到1 mg· mL-1的母液B；母液A、B各2倍稀釋共得14個濃度(1 000～3.125 μg·mL-1)的黑果腺肋花楸提取物溶液。

1.6.2 對LO2細胞增殖的毒性研究(MTT法)[14]

對LO2細胞進行復蘇傳代[15]，取對數生長期的LO2細胞，制成細胞懸液并進行細胞計數后，接種至96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h；按濃度梯度將黑果腺肋花楸提取物溶液依次加入到96孔板中，每孔40 μL，然后每孔補加60 μL培養基，繼續培養20 h；每孔加入20 μL MTT溶液，在37 ℃下培養4 h，棄去培養液；每孔加入100 μL DMSO溶液，振搖10 min，用酶標儀測定490 nm處吸光度值，取平均值，計算存活率，選取其中5個結果相近且差異較小的濃度進行降糖作用研究。

1.6.3 對LO2細胞的降糖作用

對LO2細胞進行復蘇傳代[15]，取對數生長期的LO2細胞，制成細胞懸液并進行細胞計數后，接種至96孔板中，貼壁培養12 h，棄去培養基；用PBS緩沖液洗滌2～3次，棄去洗滌液，每孔加入100 μL無糖培養基；提取物組與肝細胞高糖損傷模型組加入50 μL 25 mmol·L-1的葡萄糖溶液，對照組與空白組加入50 μL無糖培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養6 h；向提取物組與對照組加入MTT實驗選取的5個濃度的提取物溶液，按照濃度梯度每孔加40 μL，然后再補加10 μL無糖培養基，模型組與空白組每孔補加50 μL無糖培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。按葡萄糖檢測試劑盒的使用說明進行檢測，另取一個新的96孔板，分為樣本組、校準組、質控組及空白組；每孔加入200 μL葡萄糖試劑為底液，樣本組每孔加2 μL提取物溶液并混勻；校準組加入2 μL校準液；質控組加入2 μL質控液；空白組加入2 μL無糖培養基，于37 ℃反應10 min，用酶標儀測定490 nm處吸光度值，每組取平均值，按式(3)計算葡萄糖濃度(mmol·L-1)：

(3)

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數的影響(表1)

表1 乙醇體積分數對黑果腺肋花楸多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響

從表1可知，乙醇體積分數在40%～80%時，隨著乙醇體積分數的增大，多酚含量先升高后下降，黃酮含量總體逐漸升高，出膏率總體呈先下降后升高的趨勢。這是由于，多酚在植物中與蛋白質等物質一般通過氫鍵形式結合，乙醇體積分數較小時，不足以破壞氫鍵或者破壞程度不夠，而乙醇體積分數較大時，則會降低溶劑極性。當乙醇體積分數為50%時，多酚含量最高，為6.010 mg·g-1；當乙醇體積分數為70%時，黃酮含量最高，為10.237 mg·g-1；出膏率在乙醇體積分數為40%和80%時較高，分別為16.42%和17.12%。表明乙醇體積分數對黑果腺肋花楸有效物質的提取影響較大。

2.1.2 超聲功率的影響(表2)

從表2可知，超聲功率在80～200 W時，多酚含量、黃酮含量、出膏率均先下降再升高而后再下降。當超聲功率為80 W時，多酚含量最高，為6.965 mg·g-1；當超聲功率為140 W時，黃酮含量和出膏率最高，分別為12.588 mg·g-1、18.95%。表明超聲功率對黑果腺肋花楸有效物質的提取影響較大。

表2 超聲功率對黑果腺肋花楸多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響

2.1.3 提取溫度的影響(表3)

表3 提取溫度對黑果腺肋花楸多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響

從表3可知，隨著提取溫度的升高，多酚和黃酮的含量基本不變，處于一個相對穩定的狀態；而出膏率呈緩慢下降的趨勢。表明提取溫度對黑果腺肋花楸有效物質的提取影響較小。綜合考慮，確定最佳提取溫度為40 ℃。

2.1.4 提取時間的影響(表4)

從表4可知，隨著提取時間的延長，多酚含量、黃酮含量、出膏率均先升高后下降至平穩狀態。多酚含量、黃酮含量在20 min時達到最高，分別為6.968 mg·g-1、14.125 mg·g-1；出膏率在30 min時達到最高，為18.59%。表明提取時間對黑果腺肋花楸有效物質的提取影響較大。

2.1.5 液料比的影響(表5)

表4 提取時間對黑果腺肋花楸多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響

表5 液料比對黑果腺肋花楸多酚含量、黃酮含量和出膏率的影響

從表5可知，隨著液料比的增大，多酚含量、黃酮含量均先升高后下降，出膏率則先升高后緩慢下降至平穩狀態。這是由于，當原料質量一定時，增加溶劑用量有利于原料中有效成分向提取液中擴散，則多酚含量、黃酮含量升高；當溶劑增加到一定量時，原料中的有效成分大多已經溶解在提取液中了，繼續增加溶劑用量，多酚含量、黃酮含量不再升高。當液料比為15∶1時，多酚含量最高，為6.021 mg·g-1；當液料比為20∶1時，黃酮含量、出膏率最高，分別為9.270 mg·g-1、15.74%。表明液料比對黑果腺肋花楸有效物質的提取影響較大。

2.2 正交實驗結果

采用多指標綜合評分法，以各指標的最大值為參照將數據統一化，多酚含量(X)賦權30%，黃酮含量(Y)賦權30%，出膏率(Z)賦權40%，綜合評分W=(0.3X/6.462+0.3Y/12.121+0.4Z/18.03)×100，對實驗結果進行直觀分析和方差分析，確定最佳提取工藝。正交實驗的因素與水平見表6，直觀分析見表7，方差分析見表8。

表6 正交實驗的因素與水平

表7 正交實驗的直觀分析

表8 正交實驗的方差分析

由表7可知，各因素的影響大小順序為B>A>D>C；各因素影響趨勢為：B1>B3>B2，A3>A2>A1，D1>D3>D2，C3>C1>C2；理論最佳提取工藝為A3B1C3D1。由表8可知，因素B有顯著性差異，因素A、C、D均無顯著性差異。根據節能及安全方面考慮，確定最佳提取工藝為A3B1C1D1。綜合單因素實驗和正交實驗結果，確定最佳提取工藝為：超聲功率120 W、提取時間10 min、乙醇體積分數50%、液料比10∶1、提取溫度40 ℃。

2.3 驗證實驗結果

在最佳提取工藝下，進行三批次工藝驗證實驗，結果見表9。

表9 工藝驗證實驗結果

由表9可知，三批次工藝驗證實驗結果評分均達到或超過95.0，且多酚含量、黃酮含量和出膏率的RSD分別為1.60%、2.27%、0.90%，表明該工藝穩定可行。

2.4 黑果腺肋花楸提取液的抗氧化活性(圖1)

圖1 不同濃度VC和黑果腺肋花楸提取液的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of VC and Aronia melanocarpa extract solution with different concentrations

從圖1可知，VC與黑果腺肋花楸提取液的IC50值分別為9.550 μg·mL-1、0.355 mg·mL-1，根據黑果腺肋花楸出膏率為17%，將其IC50值換算為相同濃度單位，為60.350 μg·mL-1。研究[16]表明，桑葚、黑加侖和藍莓提取物的抗氧化活性大小為桑葚>黑加侖>藍莓，且桑葚提取物的抗氧化活性遠高于藍莓和黑加侖提取物，其IC50值依次為0.953 mg·mL-1、8.112 mg·mL-1、8.911 mg·mL-1；而本實驗中黑果腺肋花楸提取液的IC50值小于桑葚提取物，相較于其它漿果，黑果腺肋花楸提取液的IC50值與VC更為接近。因此，黑果腺肋花楸提取液有較強的抗氧化活性。

2.5 黑果腺肋花楸提取物的降糖活性

2.5.1 MTT法優選濃度

LO2細胞毒性實驗結果顯示，加入14個濃度(1 000～3.125 μg·mL-1)的黑果腺肋花楸提取物溶液培養的LO2細胞活力較好，黑果腺肋花楸提取物溶液對LO2細胞的增殖無顯著抑制作用，表明濃度為1 000～3.125 μg·mL-1的黑果腺肋花楸提取物溶液無肝細胞毒性。選取200 μg·mL-1、125 μg·mL-1、100 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、50 μg·mL-15個濃度的黑果腺肋花楸提取物溶液培養LO2細胞進行降糖實驗，其LO2細胞的存活率如圖2所示。

圖2 LO2細胞存活率Fig.2 Survival rate of LO2 cell

2.5.2 葡萄糖含量檢測結果(圖3)

注：**，P≤0.01，表示與模型組相比具有顯著性差異

葡萄糖含量越少，則消耗量越多，即降糖效果越好。從圖3可知，加入黑果腺肋花楸提取物溶液后，葡萄糖含量明顯下降；加入的提取物溶液濃度越高，葡萄糖含量越少。與肝細胞高糖損傷模型組相比，提取物組葡萄糖消耗量顯著提升(P≤0.01)，由5.59 mmol·L-1·(24 h)-1升至8.29 mmol·L-1·(24 h)-1。表明黑果腺肋花楸提取物具有較強的降糖活性。

3 結論

建立了黑果腺肋花楸多酚和黃酮的超聲輔助提取法，采用單因素實驗和正交實驗并通過多指標綜合評分法優化提取工藝。確定黑果腺肋花楸多酚和黃酮的最佳提取工藝為：超聲功率120 W、提取時間10 min、乙醇體積分數50%、液料比10∶1(mL∶g)、提取溫度40 ℃。黑果腺肋花楸提取物的IC50值(60.350 μg·mL-1)與VC的相近，具有較強的抗氧化活性；黑果腺肋花楸提取物溶液(1 000～3.125 μg·mL-1)無肝細胞毒性，且與肝細胞高糖損傷模型組相比，提取物組葡萄糖消耗量顯著提升，由5.59 mmol·L-1·(24 h)-1升至8.29 mmol·L-1·(24 h)-1，具有較強的降糖活性。該方法操作簡便、綠色無污染、提取率高，為黑果腺肋花楸的工業化生產奠定了基礎。