miR-124-3p通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移和增殖的研究

路明 陳哲

胃癌（Gastric cancer,GC）是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，盡管在過(guò)去幾十年中，GC 的診斷和治療水平已有顯著提高，但仍缺乏早期診斷策略和有效的治療手段[2]。miRNA（miR）是一組保守的非編碼RNA，通常由20～22 個(gè)核苷酸組成，miR 與信使目標(biāo)RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，導(dǎo)致mRNA 裂解，隨后降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。miR 在細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)展和代謝中起著重要作用，可作為生物標(biāo)志物[3]。因此，發(fā)現(xiàn)新的候選miR 極其重要，可能有助于降低死亡率和改善預(yù)后。越來(lái)越多的研究表明，miR 的異常表達(dá)與人類腫瘤增殖和遷移有關(guān)，miR-124-3p 在幾種人類腫瘤組織中呈低表達(dá)，而提高其表達(dá)水平能夠抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲[4，5]，但miR-124-3p 在GC 進(jìn)展中如何特異性發(fā)揮作用目前尚不清楚。本研究旨在探討miR-124-3p 是否通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的遷移和增殖產(chǎn)生影響，為尋找GC 治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人胃上皮細(xì)胞（GES-1）和人胃癌細(xì)胞（SGC-7901、MGC-803、BGC-823）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海細(xì)胞研究所）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；轉(zhuǎn)染所用試劑盒均購(gòu)自上海吉瑪基因有限公司；RNA 提取試劑盒、TB Green （TM） Primix Ex Taq（TM）試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Lipofectamin2000 購(gòu)自Thermo Scientific有限公司；EMT 相關(guān)蛋白vimentin、β-actin 及兔/鼠二抗均購(gòu)自武漢三鷹有限責(zé)任公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組SGC-7901 細(xì)胞中加入含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染對(duì)象為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合程度達(dá)到50%。將SGC-7901 細(xì)胞分為上調(diào)組和下調(diào)組，上調(diào)組分為Control 組（Lip2000 處理SGC-7901 細(xì)胞）、mimic-NC 組（Lip2000+miR-124-3p 擬似物mimic 轉(zhuǎn)染SGC-7901 細(xì)胞）、mimic-miR-124-3p 組（Lip2000+mimic-miR-124-3p共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞）；下調(diào)組分為Control 組（Lip2000 處理SGC-7901細(xì)胞）、inhibitor-NC 組（Lip2000+miR-124-3p擬似物inhibitor轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞）、si-miR-124-3p組（Lip2000+inhibitor-miR-124-3p共轉(zhuǎn)染SGC-7901 細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 RNA 提取及RT-PCR 檢測(cè)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁GES-1 和人胃癌（SGC-7901、MGC-803、BGC-823）細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。將提取的總RNA 按 RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，合成的cDNA 使用TB Green（TM） Primix Ex Taq（TM）試劑盒通過(guò)PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，以GAPDH 作為內(nèi)參檢測(cè)miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。分別檢測(cè)SGC-7901 細(xì)胞上調(diào)miR-124-3p 后Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p 組和SGC-7901 細(xì)胞下調(diào)miR-124-3p 后Control組、inhibitor-NC 組、si-miR-124-3p 組miR-124-3p相對(duì)表達(dá)量，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.4 MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖能力取上調(diào)組和下調(diào)組中各組轉(zhuǎn)染24h 的SGC-7901 細(xì)胞，以每孔細(xì)胞數(shù)1×104個(gè)接種于96 孔板，于24h 時(shí)每孔加入15μl MTT 溶液。放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，每孔加入150μl DMSO，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30min，待甲臜完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值（A490）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取上調(diào)組和下調(diào)組中各組SGC-7901 細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)重懸于小室中，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24h；取出小室，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定20min，結(jié)晶紫染液室溫下染色10min；PBS 清洗至溶液澄清，在200×視野下計(jì)算跨膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.6 Western blot 檢測(cè)vimentin 蛋白表達(dá)分別將上調(diào)組和下調(diào)組中各組細(xì)胞裂解提取后，使用BCA 法檢測(cè)各組vimentin 蛋白表達(dá)，SDS-PAGE 上取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳，將蛋白遷移至PVDF 膜上，牛奶封閉液封閉15min，vimentin、β-actin 按1∶1 000 稀釋，4℃條件下孵育過(guò)夜。TBST 緩沖液清洗3 次，每次洗10min，二抗按1∶5 000 稀釋，室溫下孵育2h，TBST 緩沖液清洗3 次，曝光顯影。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 miR-124-3p在GES-1和SGC-7901、MGC-803、BGC-823 細(xì)胞中的表達(dá)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GES-1、SGC-7901、MGC-803、BGC-823 細(xì)胞miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量分為1.01±0.01、0.64±0.03、0.76±0.04 及0.93±0.04。與GES-1 細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞SGC-7901 及MGC-803 細(xì)胞中的miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量降低，且SGC-7901 細(xì)胞中miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而B(niǎo)GC-823 細(xì)胞中miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 上調(diào)miR-124-3p 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞遷移能力的影響Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p組miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量分為1.00±0.03、0.96±0.04、1.52±0.08。與Control 組相比，mimic-miR-124-3p 組miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），mimic-NC 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。采用Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，mimicmiR-124-3p 組跨膜細(xì)胞數(shù)少于Control 組和mimic-NC 組，見(jiàn)圖1。Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p 組vimentin 表達(dá)量分別為1.82±0.16、1.75±0.12、0.52±0.06；與Control 組相比，mimic-miR-124-3p 組vimentin 表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），mimic-NC 組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 上調(diào)miR-124-3p 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞增殖能力的影響采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p 組細(xì)胞存活率分別為（100.0±2.0）%、（100.0±2.5）%、（66.0±3.5）%。與Control 組相比，mimic-miR-124-3p 組細(xì)胞增殖能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），mimic-NC 組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 Transwell 檢測(cè)上調(diào)組細(xì)胞遷移能力

圖2 vimentin 在上調(diào)組不同組中的表達(dá)

2.4 下調(diào)miR-124-3p 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞遷移能力的影響Control 組、inhibitor-NC 組、si-miR-124-3p 組miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量分為1.00±0.02、0.99±0.02、0.18±0.03。與Control 組相比，si-miR-124-3p 組miR-124-3p 相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），inhibitor-NC 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。采用Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，si-miR-124-3p 組跨膜細(xì)胞數(shù)大于Control 組和inhibitor-NC 組，見(jiàn)圖3。Control 組、inhibitor-NC組、si-miR-124-3p 組vimentin 表達(dá)量分別為0.43±0.03、0.44±0.02、0.81±0.05；與Control 組相比，simiR-124-3p 組vimentin 表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），inhibitor-NC 組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 Transwell 檢測(cè)下調(diào)組細(xì)胞遷移能力

圖4 vimentin 在下調(diào)組不同組中的表達(dá)

2.5 下調(diào)miR-124-3p 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞增殖能力的影響采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Control 組、inhibitor-NC 組、si-miR-124-3p 組細(xì)胞存活率分別為（100.0±1.0）%、（99.5±2.4）%、（138.4±16.8）%。與Control 組相比，si-miR-124-3p 組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），inhibitor-NC 組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

GC 是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道，僅2018年全球GC 新發(fā)病例高達(dá)103 萬(wàn)例[6]，由于飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣的不同，我國(guó)GC 發(fā)病率為東歐國(guó)家的2 倍[7]。我國(guó)GC 早期篩查體系尚不成熟，對(duì)于GC 的早期介入率并不高，致使5年生存率不足50%[8]。近年來(lái)，由于miR 具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性，已成為GC早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的研究熱點(diǎn)[9]。miR 是小的非編碼RNA，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)mRNA 的變化，并且還顯示出針對(duì)特定生物學(xué)疾?。ㄈ缥赴┑姆制诨蚪M織學(xué)類型）的差異表達(dá)。miR 作為GC 發(fā)生和轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子和潛在生物標(biāo)志物的重要性已經(jīng)得到認(rèn)可[10，11]。研究中還發(fā)現(xiàn)miR 失調(diào)與GC 臨床進(jìn)展密切相關(guān)，與此同時(shí)，miR 的表達(dá)譜還顯示，與正常組織相比，GC 組織中有超過(guò)100 種的miR 表達(dá)異常，越來(lái)越多的GC 相關(guān)miR（包括miR-101-3p、miR-20a、miR-10b-5p 和miR-143-5p 等）被認(rèn)為是潛在的GC 生物標(biāo)志物[12～14]。

miR-124-3p 與多種腫瘤相關(guān)，已有研究證實(shí)，miR-124-3p 的異常低表達(dá)與肺癌的預(yù)后相關(guān)，因此miR-124-3p 可以發(fā)揮其潛在的生物標(biāo)志物作用，用于進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)分析[15]。另一項(xiàng)研究表明，miR-124-3p 的過(guò)表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[16]。研究證實(shí)，STAT3 為miR-124-3p 下游靶基因，并且miR-124-3p 可通過(guò)負(fù)調(diào)控抑制STAT3/CCND2/MMP2 信號(hào)通路，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[17]。在GC 中miR-124-3p 的甲基化可能有助于其下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與了細(xì)胞遷移和侵襲[18]。

miR-124-3p 在GC 中作用的相關(guān)研究較少，為證實(shí)miR-124-3p 對(duì)GC 細(xì)胞的影響，本研究首先應(yīng)用RT-PCR 法檢測(cè)人胃上皮細(xì)胞和3 種人胃癌細(xì)胞中miR-124-3p 的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，miR-124-3p 在SGC-7901、MGC-803 細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下降，其中SGC-7901 細(xì)胞中表達(dá)水平最低，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用SGC-7901 細(xì)胞進(jìn)行，同時(shí)推測(cè)miR-124-3p 低表達(dá)可能為GC 發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移的重要因素。為證實(shí)這一推測(cè)，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別上調(diào)和下調(diào)SGC-7901 細(xì)胞中miR-124-3p 表達(dá)，并采用MTT 法及Transwell 檢測(cè)SGC-7901 細(xì)胞的增殖和遷移能力。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-124-3p 表達(dá)后SGC-7901 細(xì)胞增殖能力下降，同時(shí)遷移能力隨之降低；而下調(diào)miR-124-3p 后SGC-7901 細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，遷移能力亦隨之增強(qiáng)，說(shuō)明miR-124-3p 與GC 細(xì)胞增殖和遷移能力有關(guān)，miR-124-3p有望成為抑制GC 進(jìn)展及降低復(fù)發(fā)率的治療靶點(diǎn)。

目前已公認(rèn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是GC 患者癌癥相關(guān)死亡的主要原因[19]，EMT 是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步，其在腫瘤遷移的早期階段起著重要作用[20]。研究表明，腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，EMT 是否被過(guò)早激活是關(guān)鍵，其特征是細(xì)胞間粘附力的喪失以及遷移的獲得，EMT 異常激活可促進(jìn)肉瘤樣GC 的侵襲性發(fā)展[21]。vimentin 是維持細(xì)胞完整性的中間絲，在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，可驅(qū)動(dòng)EMT 的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和粘附，是腫瘤細(xì)胞EMT 支架標(biāo)記物之一[22，23]。為探討miR-124-3p 上調(diào)與下調(diào)對(duì)SGC-7901 細(xì)胞EMT 的影響，我們采用Western blot對(duì)vimentin 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示上調(diào)miR-124-3p 后SGC-7901 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白vimentin 表達(dá)下降，而下調(diào)miR-124-3p 后SGC-7901 細(xì)胞中vimentin表達(dá)增加。說(shuō)明miR-124-3p 在SGC-7901 細(xì)胞中低表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 相關(guān)，為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的原因之一，與MTT、Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上所述，在胃癌細(xì)胞中miR-124-3p 的低表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 的發(fā)生，可能是促使腫瘤細(xì)胞增殖和發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素，有望成為預(yù)測(cè)GC 患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物之一。上調(diào)miR-124-3p 可抑制SGC-7901 細(xì)胞的增殖和遷移能力，有可能成為未來(lái)對(duì)GC 患者進(jìn)行基因治療的新方向。