高效液相色譜法測定化橘紅(化州柚)配方顆粒中柚皮苷的含量

耿 碩

(頸復康藥業集團有限公司，河北 承德 067400)

橘紅以廣東省化州市所產最為道地，稱為化州橘紅。因其藥性辛、苦、溫，主要用于散寒、燥濕、利氣消痰，多用于止咳化痰立咽。化橘紅配方顆粒(也稱單方顆粒)是使用傳統科學的中藥炮制方法炮制的化橘紅飲片為原料，采用先進科學的中藥精選、提取、濃縮、干燥、制粒等加工技術精制而成的單方顆粒產品，該產品保留了原飲片的在配方顆粒劑中的主要功效與作用，方便醫生在治療過程中根據病情酌情加減，隨癥施治，它既保留了原藥材的藥性、藥效，又不需要煎煮，服用方便，服用量少，吸收快，而它成分與原藥材基本一致，療效確切，安全衛生，攜帶保存方便，易于調配更主要的是適合工業化生產等諸多優點，深得醫患認可。因橘紅同類品種不同產地的較多，作用略有不同，為了篩選道地藥材，控制化橘紅配方顆粒的質量，我們選定柚皮苷為化橘紅中藥配方顆粒的特定成分，對配方顆粒中的柚皮苷做了含量測定研究，下面是是實驗過程，試驗結果顯示，該方法簡便，快速，準確，可作為化橘紅配方顆粒含量的特定檢測方法。

1 儀器試劑與對照品樣品

高效液相色譜儀：儀器型號：Lab Alliance；檢測器：Lab Alliance泵：Lab Alliance；色譜工作站：ANASTAR；Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6×250mm)，具塞錐形瓶，容量瓶，萬分之一天平等，試劑：甲醇為色譜純試劑，水為超純水；其它試劑均為色譜純；對照品：柚皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所批號110826-201912)；樣品：藥品零售企業購買的華潤三九醫藥股份有限公司生產的化橘紅配方顆粒。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1色譜柱

色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，本實驗采用Bonshell C18Plus 4.6mm*50mm ，2.7μm色譜柱。

2.1.2流動相的選擇

參照《中國藥典》2020年版一部第74頁，“化橘紅”含量測定項下的測定方法，以甲醇-醋酸-水(35:4:61)為流動相為流動相進行條件摸索，柚皮苷的分離度大于1.5，色譜峰對稱性良好，故選用該流動相為本標準的流動相。

2.1.3柱溫

30℃可以保證柱壓較低，分離效果穩定，保留時間變化小。溫度的變化，對柚皮苷出峰時間有影響，但對峰面積的影響較小。

2.1.4檢測波長的選擇

柚皮苷在283處有吸收峰，《中國藥典》2020年版一部第74頁，“化橘紅”含量測定項下的測定方法，選用283nm處作為檢測波長。

3)中速暖機結束，檢查脹差、振動、汽缸溫度等各參數無異常，高壓內缸內壁溫度大于200 ℃，汽缸熱膨脹大于5 mm。選擇升速率100 r/min2，機組過臨界升速率自動變化為400 r/min2，升速至2000 r/min，高速暖機60 min。

2.1.5理論板數的確定

從對三批數據的測定結果可見，柚皮苷峰理論板數在1000以上，即能達到較好的分離效果,故規定理論板數按柚皮苷峰計算應不低于1000。

2.1.6對照品溶液的制備

精密秤取柚皮苷對照品，加甲醇制成每1ml 含60μg的溶液，即得對照品溶液。

2.1.7供試品溶液的制備

取化橘紅配方顆粒適量，充分混勻研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試液。

2.2 專屬性考察

陰性對照試驗；按正文[含量測定]項下的方法同法制備供試品溶液和對照品溶液。另取按相同工藝方法制備的不含化橘紅藥材的陰性對照樣品，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。在上述色譜條件下,分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各10μl，分別注入高效液相色譜儀進行測定。

圖1 HPLC色譜圖

2.3 線性關系考察

取柚皮苷對照品，精密稱定12.0mg，置100ml量瓶，加甲醇制成每1m含0.10mg的溶液，作為對照品儲備液。按照下表1進行稀釋并稀準確釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；分別精密吸取上述對照品溶液10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，峰面積對進樣量進行回歸分析，結果柚皮苷在20～120μg范圍內呈良好的線性關系。回歸方程為y=17929709.52x+ 13207.21，r=1.00。見表2、圖2。

表1 柚皮苷標準曲線

表2 柚皮苷標準曲線數值表

圖2 柚皮苷標準曲線圖

2.4 精密度試驗

取化橘紅配方顆粒適量，混勻研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，稱定重量，使用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度并搖勻，得供試液。連續進樣6針，測定柚皮苷的含量，結果見表4。

表4 供試品溶液的精密度試驗結果

結果表明，符合《中國藥典》2020年版四部 通則0512中規定的RSD值遠遠小于2.0%的要求。

2.5 穩定性試驗

對照品溶液的制備：取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取化橘紅配方顆粒，混勻研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試液。取對照品溶液、供試品溶液分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h進行測定。結果見表5。

表5 不同時間測定對照品及供試品中柚皮苷的峰面積值

從表5中數據可以看出，柚皮苷在24小時內峰面積積分值基本恒定不變。能夠滿足測定所需要時間內的穩定性。

2.6 重復性試驗

取同一批號化橘紅配方顆粒供試品6份，各約0.10g，精密稱定，分別按前述[含量測定]項下方法操作，測定每份供試品的含量，結果見表6。

表6 供試品中柚皮苷含量重復性試驗結果

結果表明，供試品在相同的細度、相同的提取溶劑和色譜條件下，重復性較好。

2.7 加樣回收試驗

取已知含量 (批號：20201034-1，含量為131mg/g)的化橘紅配方顆粒分成6份，混勻研細，取樣品約0.02g，對照品約13.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，各取續濾液10μl進樣，分別按正文[含量測定]項下的色譜條件測定每份的含量，計算回收率，結果見表7。

表7 柚皮苷回收試驗結果

結果：本方法的平均回收率為96.60 %，符合《中國藥典》2020年版四部 9101“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”中“表2 樣品中待測定成分含量和回收率限度”的要求。

2.8 樣品含量測定

取3批化橘紅配方顆粒樣品(批號：20201034-1,20201034-2 ,20201034-3)分別秤取約0.10g，各兩份，精密稱定，按前述[含量測定]項下的方法處理并測定，所得含量測定結果見表8。

表8 樣品中柚皮苷的含量測定結果

從表8中的三批樣品含量測定的數據可見，化橘紅配方顆粒中含柚皮苷最低含量在130mg/g以上。考慮不同批次藥材質量受各種因素影響含量會有差異，因此我們將化橘紅配方顆粒中的柚皮苷含量下浮30%做參考含量，含量限度為130g×70%=91.0(mg/g)。通過以上試驗論證，我們將化橘紅配方顆粒中柚皮苷含量擬定為每1g化橘紅配方顆粒中含柚皮苷(C27H32O14)不得少于91.0mg。

3 討論

選取甲醇為溶媒，以柚皮苷提取量為考察指標，考察方法為： 取化橘紅配方顆粒，混勻，研細，取約0.10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇86ml，稱定重量，水浴回流加熱60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

根據以上試驗結果，樣品中柚皮苷含量轉移率為96.0%(大于95%),基本提取完全，因此本品的提取溶劑和提取方法是可以使用的。