奶牛Klf4基因CDS區和3′UTR的克隆及生物信息學分析

徐 萍, 趙 儉, 姚競杰, Fotina Tetiana, 王三虎, 張曉建

(1.河南科技學院動物科技學院，河南 新鄉 453003；2.新鄉學院生命科學與基礎醫學學院，河南 新鄉 453003；3.烏克蘭蘇梅國立農業大學獸醫學院，烏克蘭 蘇梅 40021；4.河南盧師傅食品有限公司，河南 商丘 476600)

奶牛乳腺炎是由病原微生物感染、理化因素刺激或者奶牛自身遺傳等因素引起的一種常見的乳腺綜合征疾病，它不僅可導致奶牛產奶量下降，也可由于治療時化學藥物或抗生素殘留等原因造成乳制品質量降低，甚至危及人類健康[1].Krüppel樣因子(Krüppel-like factor, KLF)是鋅指蛋白類轉錄因子，在人類組織中廣泛表達.KLF于1996年由Shields et al[2]在小鼠中發現，因與黑腹果蠅的分節蛋白Krüppel的DNA結合序列具有同源性而得名.Krüppel樣因子4(Krüppel-like factors 4, KLF4)屬于KLF蛋白家族一員，是一種具有結合位點特異性真核生物鋅指蛋白轉錄因子，參與調控細胞增殖和分化、胚胎發育，抑制和促進腫瘤發展，參與骨骼分化等重要生命過程，是體細胞重編程為誘導多能干細胞(iPS細胞)的重要誘導因子之一[3-6].在癌癥病情繼續發展期間，KLF4可以作為腫瘤啟動子或者抑制劑起作用，這取決于癌癥類型和細胞標記[7].研究表明，KLF4可單獨或者與其他信號途徑協同調節多種細胞因子的表達，在炎性反應中發揮重要作用[8-9].KLF4在巨噬細胞中具有促進和抑制炎癥的作用.馮衍生等[10]研究表明，KLF4在小鼠RAW264.7細胞的膿毒癥中顯著抑制IL-6啟動子的轉錄活性，從而通過顯著降低IL-6的表達抑制細胞的炎癥反應.Wt鼠在移植KLF4缺乏細胞血液中單核細胞較前減少，血液和脾臟中炎性單核細胞完全缺乏，證明KLF4是炎性單核細胞分化不可缺少的分子[11]；同時，KLF4在神經系統[12-13]、心血管系統[14-15]、泌尿系統[16-17]、呼吸系統[18-19]、消化系統[20-21]和皮膚系統[22-24]疾病中均可抑制炎癥反應.KLF4作為KLF家族中的一員，在體內多種細胞和組織中均有表達；從炎癥反應的角度看，KLF4可作用于不同信號通路，既可抗感染，又可促炎癥.而Klf4基因在奶牛乳腺炎中的作用目前尚未見報道.

本研究通過對奶牛Klf4基因CDS區和3′UTR序列的克隆、表達載體的構建，并通過不同物種同源性比對和系統進化樹構建分析Klf4基因遺傳進化特性，最后對Klf4基因編碼蛋白的特性進行生物信息學分析，以期為進一步研究Klf4基因在奶牛乳腺炎中的作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 選取3歲左右、健康的中國荷斯坦奶牛3頭，采集其乳腺組織并迅速保存于液氮中備用.

1.1.2 試劑 PrimeScriptTMRT Master Mix、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ、pMD18-T載體、限制性內切酶、T4連接酶購于寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞購于北京全式金生物有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購于OMEGA公司；RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司；PMIR-REPORTTM載體由河南科技學院動物科技學院實驗室保存.

1.2 方法

表1 Klf4基因的擴增及定量引物序列1)Table 1 Amplification and quantitative primer sequences of the Klf4 gene

1.2.1 引物的設計與合成 根據NCBI數據庫中牛的Klf4基因序列，結合NCBI的Primer-blast功能和Primer 6.0軟件進行引物設計，引物序列如表1所示.引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成.

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 參照百泰克RNA提取試劑盒說明書從乳腺組織中提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop檢測RNA的純度和濃度.參考RT-PCR試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA.

1.2.3Klf4基因CDS區的克隆Klf4基因的PCR反應條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；62 ℃，30 s；72 ℃，60 s；72 ℃，10 min；4 ℃保存.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收濃度較高的特異性條帶，與pMD18-T載體連接、轉化.挑取陽性單克隆菌落測序.

1.2.4Klf4基因3′UTR的擴增及PMIR-Klf4-3′UTR重組質粒的構建 PCR反應條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，30 s；63.4 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，10 min；4 ℃保存.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收.將回收得到的目的條帶與PMIR-REPORTTM載體分別用限制性內切酶HindⅢ和MluⅠ酶切后，經T4連接酶連接、轉化.挑取陽性單克隆菌落測序.

1.2.5 生物信息學分析 利用NCBI獲取不同物種的Klf4基因序列，并使用DNAstar、Mega 6.0軟件計算奶牛與不同物種間的遺傳距離、同源性以及進化樹的構建；使用ProtParam軟件預測基因編碼蛋白的理化性質；使用ProtScale軟件進行親/疏水性分析；利用Net Phos 3.1、PSORTⅡ和TargetP 1.1軟件進行磷酸化位點和亞細胞定位分析；利用SignalP-4.1軟件的Sever程序進行蛋白信號肽預測；利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件預測蛋白的二級結構和三級結構.

2 結果與分析

2.1 Klf4基因CDS區的克隆

M：DL2000 marker；1～4：樣品擴增產物.圖1 Klf4基因CDS區的擴增電泳圖譜Fig.1 PCR amplification electrophoresis product of the Klf4 gene CDS

Klf4基因CDS區的擴增結果如圖1所示.結果顯示檢測到長度為1 400 bp左右的目的條帶，條帶明亮清晰，且與預期大小一致.測序結果經比對，顯示與NCBI中牛的Klf4基因序列一致.

2.2 Klf4基因3′UTR的擴增

Klf4基因3′UTR的擴增結果如圖2所示.結果顯示檢測到長度為366 bp的目的條帶，片段大小符合預期結果.利用限制性內切酶對重組質粒進行雙酶切，得到長度分別為366和6 470 bp大小的兩條帶，與預期一致.

2.3 Klf4基因及蛋白序列的生物信息學分析

2.3.1 同源性分析和進化樹的構建 牛Klf4基因與兔、山羊、斑馬魚、人、小鼠、野豬、綿羊、大鼠的同源性分別為92.9%、98.5%、54.9%、82.8%、88.4%、94.7%、98.3%、88.6%(圖3).基于KLF4氨基酸序列同源性構建的系統發育進化樹(圖4)顯示，牛Klf4基因與山羊、綿羊的親緣性最近，達到98%以上，然后是豬，最后是斑馬魚.

A：擴增(M為DL2000 marker；1～3為樣品擴增產物)；B：酶切(M為DL5000 marker；1為PMIR-Klf4-3′UTR質粒雙酶切產物).圖2 Klf4基因3′UTR的擴增和酶切電泳圖譜Fig.2 Amplification and digestion products of the Klf4 gene 3′UTR

2.3.2 氨基酸的理化性質 采用ProtParam軟件對奶牛Klf4基因所編碼氨基酸序列的理化性質進行分析.結果顯示，KLF4氨基酸序列由477個氨基酸組成，其分子質量為50 759.17 u，分子式為C2231H3458N652O669S20，總原子數為7 030.帶正負電荷的殘基數分別為48個(精氨酸+賴氨酸)和41個(天冬氨酸+谷氨酸)，理論等電點(pI)為8.76，偏堿性.預測不穩定系數為69.28，說明Klf4基因編碼蛋白的理化性質是不穩定的，理論半衰期在哺乳動物網織紅細胞體外為30 h，而在酵母的體內則需要大于20 h，在大腸桿菌的體內則需要大于10 h.由于其脂肪系數為59.39，總平均親水系數(GRAVY)為-0.550，說明該蛋白屬于親水性蛋白，與ProtScale軟件分析結果一致(圖5).而在組成牛Klf4基因編碼氨基酸的20種氨基酸中，脯氨酸的含量最多，其比例為13.6%(表2).

圖3 不同物種Klf4基因的同源性比對結果Fig.3 Homology comparison of Klf4 gene sequence from different species

圖4 基于KLF4氨基酸序列同源性構建的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on KLF4 amino acid sequence homology

圖5 奶牛KLF4蛋白親/疏水性Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of KLF4 protein in dairy cow

2.3.3 磷酸化位點、亞細胞定位和信號肽 利用Net Phos 3.1軟件預測Klf4基因編碼氨基酸序列的潛在磷酸化位點，其中可能存在56個磷酸化位點，包含16個蘇氨酸磷酸化位點、37個絲氨酸磷酸化位點、3個酪氨酸磷酸化位點(圖6).奶牛KLF4蛋白亞細胞定位的預測采用TargetP 1.1和PSORTⅡ軟件，結果顯示線粒體作用位點(mTP)占21.3%，分泌信號通路位點(SP)占12.3%，無信號肽的存在，說明KLF4蛋白不屬于分泌型蛋白，且分布于細胞核，可能在396、426、456位點處存在鋅指結構域(表3)，這與KLF蛋白家族的特性相一致.通過SignalP-4.1軟件的Sever程序分析KLF4蛋白的信號肽，結果顯示KLF4蛋白不存在信號肽.

表2 奶牛KLF4氨基酸組成成分Table 2 Amino acid composition of KLF4 protein in dairy cow

圖6 奶牛KLF4蛋白磷酸化位點Fig.6 The prediction of phosphorylation site of KLF4 protein in dairy cow

表3 奶牛KLF4蛋白亞細胞定位Table 3 Subcellular localization of KLF4 protein in dairy cow

2.3.4 二級結構和三級結構預測 牛KLF4蛋白的二級結構采用SOPMA軟件預測，結果顯示，α-螺旋占18.03%，無規則卷曲占68.76%，β-轉角占3.98%，延伸鏈占9.22%(圖7).KLF4蛋白的三級結構與二級結構一致(圖8).

字母“c”和紫色短豎線表示無規則卷曲；字母“h”和藍色長豎線表示α-螺旋；字母“e”和紅色中長豎線表示延伸鏈；字母“t”和綠色中短豎線表示β-轉角.圖7 奶牛KLF4蛋白二級結構的預測結果Fig.7 The prediction of secondary structure of KLF4 protein in dairy cow

3 討論

圖8 奶牛KLF4蛋白三級結構的預測結果Fig.8 The prediction of tertiary structure of KLF4 protein in dairy cow

奶牛乳腺炎是影響奶牛養殖業的主要疾病，不僅降低了奶牛的產奶量，同時造成了乳制品質量的下降[1].盡管國內外學者在生理學、生物學和遺傳學等多學科上做了大量研究，取得了大量進展，但奶牛乳腺炎致病機制中仍有許多生物學機制亟待研究.近年來的研究顯示，miRNA在固有免疫、病原體感染與免疫以及炎癥免疫調控中具有十分重要的作用[25-26].miRNA通過與其種子序列互補配對的靶基因結合，引起靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平調控基因的表達.奶牛miRNA與其靶基因互作在奶牛乳腺炎中的分子機制是近期研究乳腺炎致病機制的重要方法.KLF4是一種具有結合位點特異性真核生物鋅指蛋白轉錄因子，屬于KLF蛋白家族一員，具備KLF蛋白家族的結構特性.在人乳腺癌細胞系中，Klf4基因敲除后乳腺癌細胞標志物明顯減少，乳腺癌細胞增殖、遷移及裸鼠成瘤均受到明顯抑制，說明Klf4基因可以促進乳腺癌細胞的生長、遷移和浸潤[27].為探究Klf4基因在奶牛乳腺炎中靶向調控miRNA的作用，本研究通過擴增Klf4基因3′UTR區域，獲得長度為366 bp的目的片段，并構建PMIR-REPORTTM-Klf4重組質粒，為研究其互補配對miRNA之間的作用提供參考.

人Klf4基因定位于染色體9q31，覆蓋6 300 bp的基因段，包含5個外顯子，其開放式閱讀框(ORF)長度為1 413 bp，編碼470個氨基酸[28].將克隆的人Klf4基因全長序列與慢病毒載體pCDH連接，重組載體pCDH-Klf4轉染人膀胱癌5637細胞，Klf4基因mRNA表達明顯增高.通過在膀胱癌細胞系中過表達Klf4基因可以抑制腫瘤細胞的增長并促進凋亡，說明Klf4基因在膀胱腫瘤的形成和發展中具有抑制作用[29-30].而小鼠的Klf4基因定位于染色體4B3，編碼483個氨基酸，小鼠與人的KLF4蛋白高度同源，在羧基端與人的KLF4有103個氨基酸殘基完全一致.攜帶小鼠Klf4基因的重組慢病毒載體pLVX-Klf4轉染RAW264.7細胞，Klf4基因的過表達促進了RAW264.7細胞的增殖[31].豬的Klf4基因位于染色體1q28～29處，編碼區全長1 533 bp.對豬Klf4基因原核、真核和慢病毒表達載體的構建，主要用于驗證Klf4基因在豬成脂分化和前脂肪細胞中的作用[32-34].為了研究大熊貓Klf4基因的結構和功能，近期吳宏娟等[35]通過RACE技術克隆了大熊貓Klf4基因，cDNA序列全長2 431 bp，其中，CDS區域長1 437 bp，編碼479個氨基酸.與人、小鼠KLF4比較，大熊貓KLF4的N端少了9個氨基酸殘基.利用RNA-seq技術研究Klf4基因在大熊貓MSCs中的調控作用，發現大熊貓Klf4基因在進化過程中相對保守，在細胞增殖、細胞凋亡、RNA轉運和蛋白質生物過程中發揮重要的生理作用.研究表明，在乳腺癌中，Klf4基因通過減少snail(上皮間質化與轉移的關鍵中介)的表達，從而抑制上皮—間質轉化，進而抑制腫瘤的轉移[36].Klf4基因在上皮—間質轉化的過程中能夠激活上皮基因的轉錄并且抑制間質基因的表達.Klf4基因在正常細胞、癌細胞、干細胞重編程及上皮—間質轉化過程中發揮著重要作用.奶牛乳腺炎是炎癥引起的乳腺上皮細胞的間質轉化.Klf4基因在奶牛乳腺炎引起的乳腺上皮細胞間質轉化中可能存在潛在的調控作用.

本研究成功克隆了牛Klf4基因，其CDS序列全長1 434 bp，編碼477個氨基酸殘基，定位于8號染色體.牛Klf4基因與人、小鼠、豬的Klf4基因的同源性分別為82.8%、88.4%和94.7%.在KLF4蛋白羧基端的DNA結合結構域含有3個連續的C2H2鋅指結構，符合KLF蛋白家族鋅指蛋白轉錄因子的結構特性[9].但牛的KLF4蛋白不存在跨膜結構，也無信號肽，存在較多個磷酸化位點.奶牛Klf4基因CDS區域的克隆為進一步構建表達載體、研究KLF4蛋白的表達在奶牛乳腺上皮細胞(BMEC)中的作用提供了參考.