基于SSNNPP分子標(biāo)記的玉米雜交種基因型分析與純度鑒定

尹祥佳，李 晶，王雅琳，王劍虹，翟 琛，郝 楠，焦珍珍

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 甘肅，蘭州 730070；2.北京通州國(guó)際種業(yè)科技有限公司 北京 101100）

玉米(Zea mays L.)是我國(guó)第一大糧食作物，也是重要的飼料和工業(yè)加工原料[1-2]。中國(guó)報(bào)告網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)2019年玉米播種面積達(dá)到4128萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量達(dá)到2.6億噸，玉米種植面積和總產(chǎn)量均為糧食作物之首，對(duì)保障我國(guó)糧食安全起到了關(guān)鍵作用。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019 年底我國(guó)玉米品種審定總數(shù)為14495 個(gè)，其中國(guó)審品種1978個(gè)，地方審定品種數(shù)12517個(gè)。

近些年，我國(guó)玉米制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了豐富的玉米種植品種數(shù)量。甘肅省是國(guó)內(nèi)重要的玉米制種地基，在河西走廊建有國(guó)家級(jí)的玉米種子生產(chǎn)基地。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，2019 年全省有玉米種子企業(yè)130 家，玉米種子生產(chǎn)面積8.26萬(wàn)hm2，產(chǎn)種5億公斤，面積和產(chǎn)量分別占全國(guó)玉米制種總面積和總產(chǎn)量的48%和51%。玉米種子質(zhì)量是保障玉米種植業(yè)發(fā)展的重要生產(chǎn)資料，直接影響到玉米種植的產(chǎn)量和糧食品質(zhì)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，SNP分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于玉米種質(zhì)資源的遺傳背景和多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、品種真實(shí)性和純度鑒定、分子輔助選擇育種等方面。何冰紓等[4]應(yīng)用SNP分子標(biāo)記對(duì)陜單609的雜種優(yōu)勢(shì)模式進(jìn)行了分析，對(duì)于玉米自交系的選育和組配提供了依據(jù)。鄭德波等[5]利用SNP 對(duì)2 個(gè)F2:3 群體對(duì)株高和穗位高性狀進(jìn)行了分析，發(fā)掘出了一些新的株高和穗位高的QTL。吳金鳳等[6]采用SNP 標(biāo)記分析了51 份玉米自交系的基因型，并將其劃分成了7 個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群，有效提高了玉米新品系的選育效率。覃嘉明等[7]應(yīng)用SNP 構(gòu)建玉米高密度遺傳圖譜，研究得出了控制玉米禿尖的主效QTL。李雪等[8]采用SNP 芯片檢測(cè)技術(shù)研究了先玉335、鄭單958和京玉7號(hào)等11份玉米雜交種的品種真實(shí)性，同時(shí)與SSR 熒光標(biāo)記分析進(jìn)行了比較研究。姚宗澤等[9]驗(yàn)證了SNP 檢驗(yàn)玉米雜交種純度的可靠性，擴(kuò)展了玉米雜交種純度的鑒定方法。因此我們選取6 份甘肅省內(nèi)推廣的玉米雜交種作為研究對(duì)象，應(yīng)用LGC SNP 高通量基因分型檢測(cè)平臺(tái)（KASP 技術(shù)）開(kāi)展玉米雜交種基因型分析與純度鑒定研究，為我省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略背景下玉米制種品種質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在玉米種子市場(chǎng)購(gòu)買了金穗1203、金穗4 號(hào)、武科8號(hào)、金艾130、方玉36和甘玉801等6份玉米雜交種作為試驗(yàn)材料。

1.2 SNP標(biāo)記引物

利用Primer Express Software v3.0.1 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和分型探針，并由生物技術(shù)公司合成，SNP標(biāo)記信息見(jiàn)表1。

表1 SNP標(biāo)記信息

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 根據(jù)文獻(xiàn)[10]的報(bào)道，采取改良的CTAB 法提取基因組DNA。DNA 質(zhì)量和濃度用Nano-Drop2000(Thermo Scientific)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量，調(diào)節(jié)工作液濃度。

1.3.2 PCR 反應(yīng)體系 PCR 反應(yīng)體系配置在96 孔板中，反應(yīng)體系為5μl，其中，DNA(50ng/μl)1μl，KASP Mix2.5μl，primer Mix0.1μl，ddH2O1.4μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，57℃復(fù)性60s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)后72℃終延伸10min，4℃Forever，復(fù)性溫度根據(jù)不同引物進(jìn)行調(diào)整。

1.3.3 玉米雜交種的SNP 基因型分析和純度鑒定 每份雜交玉米種隨機(jī)取96 粒種子作為檢測(cè)樣品，采取改良的CTAB法提取基因組DNA后用SNP標(biāo)記引物分別進(jìn)行PCR 反應(yīng)，然后用LGC SNP 高通量基因分型檢測(cè)平臺(tái)讀取數(shù)據(jù)。計(jì)算玉米雜交種的純度公式為P（%）=(NT-ND)/NT×100，其中，P為種子純度；NT供檢種子數(shù)；ND雜交種子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米樣品基因組DNA提取質(zhì)量分析

用NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的玉米雜交種基因組DNA 濃度，并調(diào)節(jié)濃度為50ng/μl，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，提取的玉米基因組DNA質(zhì)量適合PCR擴(kuò)增。

2.2 SNP基因型分析與純度鑒定結(jié)果

每份玉米品種隨機(jī)選取96粒種子樣品單獨(dú)提取基因組DNA 作為PCR 擴(kuò)增模板，分別用SNP 標(biāo)記引物進(jìn)行了基因型分析（圖2）和純度鑒定（表2）。等位基因的探針?lè)謩e是VIC（綠色）和FAM（藍(lán)色）。純度鑒定值在95.83%-98.96%之間，符合玉米雜交種純度的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 玉米基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

圖2 玉米品種的SNP基因型分析結(jié)果

表2 純度鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究者開(kāi)發(fā)了大量的玉米SNP標(biāo)記位點(diǎn)，隨著各種檢測(cè)平臺(tái)的推廣使用，玉米品種的SNP 鑒定技術(shù)也在快速發(fā)展[11]。SNP 標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）推薦為農(nóng)作物品種鑒定和指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的方法之一，主要有SNP芯片平臺(tái)、樣本高通量的原位掃描平臺(tái)（LGC公司KASP技術(shù)，Life公司Taqman技術(shù)）、位點(diǎn)和樣本高通量的靶向測(cè)序技術(shù)等，數(shù)據(jù)讀取基于二等位變異和熒光檢測(cè)系統(tǒng)[12-15]。

目前，SNP 分子標(biāo)記技術(shù)作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用于玉米雜交種純度的鑒定成為重要的研究?jī)?nèi)容。SNP分子標(biāo)記在玉米種子質(zhì)量檢測(cè)過(guò)程中具有一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：一是具備高通量檢測(cè)的技術(shù)支撐，二是標(biāo)記位點(diǎn)在玉米10 條染色體上分布密度高且分布均勻，檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)比較簡(jiǎn)單，軟件直接讀出試驗(yàn)結(jié)果；三是檢測(cè)過(guò)程不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用試劑相比較SSR 標(biāo)記的危害較小，符合綠色環(huán)保的要求。

SNP 分子標(biāo)記相比較其它分子標(biāo)記，在玉米基因型分析和品種純度鑒定中的應(yīng)用將更加廣泛。我們采用SNP 分子標(biāo)記中的KASP 技術(shù)對(duì)甘肅省內(nèi)推廣的6 份玉米雜交種進(jìn)行了純度鑒定，結(jié)果顯示4對(duì)SNP引物均能準(zhǔn)確的得出試驗(yàn)數(shù)據(jù)，純度鑒定結(jié)果在95.83%-98.96%之間，說(shuō)明了SNP 分子標(biāo)記KASP 技術(shù)結(jié)果可靠，能夠有效實(shí)現(xiàn)了高效率、高靈活性、簡(jiǎn)便快捷、低成本的檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可以作為玉米雜交種純度檢測(cè)的新方法，并在今后基于SNP標(biāo)記的玉米品種分子鑒定中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，能夠有效為我省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略背景下玉米制種品種質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)研究提供技術(shù)參考。