CTC、HER2 及PI3KCA 在轉移性乳腺癌中的表達

桑玉玉 喻海忠

江蘇省南通市中醫院檢驗科，江蘇南通 226001

乳腺癌在全球患病率、死亡率均較高[1]。研究表明每年全球乳腺癌新發確診病例約為130 萬，死亡人數約45 萬[2]。在歐美國家，乳腺癌在各類癌癥中的占比為25%～30%[3]。目前，我國乳腺癌患病率逐年增長，與此同時，其治療手段也逐漸增多，包括化療、放療、手術切除、生物細胞干預、靶向干預等，在一定程度上提升了遠期生存率。然而，即便如此，仍然有約33%的患者在5 年內發生病灶轉移，預后欠佳[4-5]。為了改善預后，臨床需采取措施及時發現轉移性腫瘤，并進行干預，但現有技術針對轉移性乳腺癌的檢出率較低。循環腫瘤細胞（CTC）既往被用于乳腺癌化療效果評估中，其能反映癌癥進展情況[6-7]。人類表皮生長因子受體2（HER2）過表達已被證實能增強乳腺癌侵襲性，與其進展過程密切相關[8]。磷脂酰肌醇-3-激酶催（PI3K）信號通路在腫瘤進展中大多處于失調狀態，這可致通路功能發生變化，誘發細胞轉化[9]。本研究旨在分析CTC 與HER2、PI3KCA 在轉移性乳腺癌中的表達意義，為該病診療提供依據，報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取江蘇省南通市中醫院（以下簡稱“我院”）2018 年4 月—2019 年6 月收治的轉移性乳腺癌患者50 例作為病例組，選取同期于我院體檢的健康婦女50 名作為正常組。病例組年齡36～85 歲，平均（56.90±10.03）歲；體重指數18～24 kg/m2，平均（21.01±0.84）kg/m2；病例類型：浸潤性導管癌34 例，非浸潤性導管癌16 例；內臟轉移：有8 例，無42 例；轉移灶數量1～3 個，平均（1.82±0.46）個。正常組年齡34～86 歲，平均（58.67±9.92）歲；體重指數18～24 kg/m2，平均（21.12±0.79）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。研究方案獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ①病例組均經CT、MRI、病理穿刺證實為轉移性乳腺癌；②兩組均順利完成指標檢測，臨床資料完整；③所有受試者均知情同意。

1.2.2 排除標準 ①存在出血傾向，或因慢性炎癥等引起的難愈合傷口；②伴其他原發性腫瘤或血液系統病、器質性心臟疾病；③近3 個月內存在放療、化療史；④合并嚴重感染。

1.3 方法

所有納入者分別于就診/體檢當日采血測定各指標，在空腹狀態下，采集6 mL 肘靜脈血，分裝于3 個無菌試管內，每管2 mL。①CTC 檢測：取2 mL 靜脈血，在空腹狀態下采集。經微流芯片法檢測CTC，檢測過程直接在芯片內實現。首先，血樣進入芯片，取PBS沖洗液200 μL 對芯片予以沖洗。其次，取Triton x-100 PBS 液（濃度為0.2%）20 μL 加入芯片內，反應10 min，有助于細胞膜破裂。取清洗緩沖液200 μL 對芯片予以清洗，取20 μL 1%牛血清白蛋白對芯片進行處理，反應10 min，行免疫熒光染色。經倒置顯微鏡與配套軟件進行分析、觀察。②HER2 檢測：經化學發光法測定HER2 蛋白，取2 mL 血樣，離心半徑16 cm，轉速為3000 r/min，離心15 min，分離血清，化學發光免疫分析試劑盒由北京百奧萊博科技有限公司提供（貨號：ZN2161-KCJ），嚴格根據說明書完成各項操作，并進行質量控制。③CF-DNA 中PI3KCA 含量檢測：根據試劑說明書，使用德國QIAGEN 公司生產的Qiamp DNA 試劑盒（貨號：51504）分別從病例組和正常組血清中提取和純化游離DNA。同時，設計針對PI3KCA 短片段的上下游引物，序列如下，Fw：5’-CTCCACGACCATCATCATCAGGT-3’，Rev：5’-TGGTTAT-TAATG-AGCCTCACGG-3’。將樣本置于7500 實時熒光儀托盤中，在95°C 90 s；40 個循環，95°C 15 s；54°C 45 s 的條件下擴增。將已知濃度的人類基因組DNA標準品進行梯度稀釋，構建標準曲線，用于推算樣品量。當重復樣本之間的差異大于1 個周期閾值時，重復分析。在相同的8 個樣品上分別進行2 次實時實驗，以測試分析不精確性。然后計算PI3KCA 短片段的變異系數。④血清癌胚抗原（CEA）、糖類抗原15-3（CA15-3）：經化學發光法測定，試劑盒由上海撫生實業有限公司提供（貨號：FS17620），根據說明書操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，采用t 檢驗；計數資料用例數百分比（%）表示，采取χ2檢驗；經Kappa 檢驗分析相關指標診斷與病理診斷一致性；經Pearson 線性模型分析CTC、HER2 蛋白量、CF-DNA 中的PI3KCA 含量與CEA、CA15-3 的相關性。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量表達比較

病例組CTC、HER2 以及CF-DNA 中PI3KCA CFDNA 含量均高于正常組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量比較（）

表1 兩組CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量比較（）

注：CTC：循環腫瘤細胞；HER2：人類表皮生長因子受體2；PI3KCA：磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α

2.2 CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量聯合診斷與病理診斷一致性分析

三者聯合診斷轉移性乳腺癌的靈敏度為86.00%，特異度為90.00%，準確率為88.00%，陽性預測值為89.58%，陰性預測值為86.54%，與病理診斷一致性為0.760（高度一致）。見表2。

表2 CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量聯合診斷與病理診斷一致性分析（例）

2.3 兩組血清CEA、CA15-3 含量比較

病例組血清CEA、CA15-3 含量顯著高于正常組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清CEA、CA15-3 含量比較（）

表3 兩組血清CEA、CA15-3 含量比較（）

注：CEA：癌胚抗原；CA15-3：糖類抗原15-3

2.4 CTC、HER2、CF-DNA 中PI3KCA 含量與血清CEA、CA15-3 的相關性

Pearson 分析提示CTC 與血清CEA、CA15-3 呈正相關（r=0.752、0.801，均P <0.05）；HER2 與血清CEA、CA15-3 呈正相關（r=0.691、0.702，均P <0.05）；CF-DNA 中PI3KCA 含量與血清CEA、CA15-3 呈正相關（r=0.628、0.611，均P<0.05）。

3 討論

乳腺癌在女性癌癥患者中死亡率約達14%。雖然臨床針對該病的診療水平較過去明顯提升，但仍然有部分病例經輔助干預后，病灶出現復發、轉移，演變成進展期乳腺癌，增加治療難度[10-12]。轉移性乳腺癌死亡率高，既往行常規MRI、CT 等檢查，雖然對病情診斷有一定價值，但無法了解治療靶點是否發生變化，難以為靶向干預提供依據[13]。因此，臨床需尋求有效指標為其診療提供依據。

本研究顯示，與正常組比較，病例組的CTC、HER2以及CF-DNA 中PI3KCA 表達量明顯增高。CTC 是原發病灶或轉移病灶脫落所致的一類細胞，可通過生物學行為進入血液內[14]。研究表明癌癥患者在化療前，CTC 數量較多，其在外周血中處于較高表達水平，經化療后，CTC 數量明顯減少[15]。另有研究認為CTC 表達與癌癥患者預后密切相關，其表達越高，則生存率越低，表達越低，預后往往越好[16]。研究指出健康者未能檢測到CTC[17]。本研究則發現正常組中也檢出CTC，這可能是因操作過程中受客觀因素干擾所致，未來將對此進行更深入的論證。HER2 已被證實在乳腺癌患者中陽性率較高，且在病灶復發環節中，HER2 狀態發生明顯變化[18-20]。HER2 在血清中表達增高表明病灶具備更強侵襲性，其對化療效果具有一定預測價值[21]。有研究者針對乳腺癌患者進行研究，提示分期越高，HER2 在血清中表達程度越高[22]。這也證實HER2 表達與乳腺癌進展程度密切相關，對該病進展有較高評估價值。PI3K-AKT 信號通路激活對腫瘤細胞有調節作用，它與病灶侵襲轉移密切相關[23]。研究表明乳腺癌復發者的PI3K 陽性率高于非復發者[24]。此外，有學者證實PI3K-AKT 路徑激活可導致機體對化療藥物耐藥性的形成，影響療效[25]。在本研究中，筆者針對上述三項指標進行分析，證實三者在轉移乳腺癌中表達增高，臨床需引起重視。

筆者發現三者聯合診斷時效果更顯著，與病理結果一致性較高。血清CEA、CA15-3 是評價惡性腫瘤的常用指標，對腫瘤性質鑒別有重要意義。研究表明乳腺癌患者血清CEA、CA15-3 含量能反映化療效果[26-28]。筆者發現與CTC、HER2、PI3KCA 與血清CEA、CA15-3含量均有相關性。因此，未來可根據CTC、HER2、PI3KCA表達的變化，推測血清CEA、CA15-3 含量的變化。

綜上，轉移性乳腺癌患者的CTC、HER2、CF-DNA中PI3KCA 表達水平較正常者明顯增高，三者均能作為預測該病的重要指標，與病理診斷一致性良好，與血清CEA、CA15-3 含量存在相關性。此外，本研究也有不足，如未分析三者對患者遠期預后的影響，未來將對此予以探討。