樹脂在中藥多糖脫蛋白中的應用進展*

孫延平，劉 艷，楊炳友，王 蒙，王秋紅，匡海學

（1.黑龍江中醫藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室 黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國科學院 大連化學物理研究所 藥用資源開發實驗室，遼寧 大連116023；3.廣東藥科大學 中藥學院 中藥炮制學教研室，廣東 廣州512000）

近20年來，由于中藥中多糖類成分具有多方面的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、抗凝血、降血糖和免疫調節等，引起了醫藥學和化學界越來越多的關注和重視，中藥多糖具有廣闊的新藥開發前景。然而，中藥多糖大多是用水溶液提取獲得，因而中藥多糖被提取的過程中，同樣是水溶性的蛋白質也被同時提取出來，干擾了后續多糖的結構和功能性質的測定。因此，多糖脫蛋白是中藥多糖實際應用中首要解決的問題。近年來，樹脂被廣泛應用于天然產物中生物活性成分的純化，樹脂具有回收率高、選擇性好、吸附條件溫和、操作成本低、易于再生等優點，可以獲得純度較高的天然產物，為天然產物的研究提供了極大的便利。本文從樹脂脫蛋白原理、影響因素及樹脂在中藥多糖脫蛋白中的應用兩方面對近15年的文獻報道進行總結，為實際中藥多糖生產開發應用提供參考。

1 樹脂脫蛋白原理及影響因素

1.1 樹脂脫蛋白原理

大孔吸附樹脂，是一種耐用性強的極性、非極性或微親水性聚合物，具有很高的吸附能力。它可以通過靜電作用、氫鍵作用、絡合作用和分子篩作用選擇性地吸附水和非水體系中的目標組分。因此，大孔吸附樹脂被廣泛應用于生物粗樣品中目標成分與其它雜質的分離。與化學法相比，大孔吸附樹脂作為粗多糖提取液的脫蛋白試劑具有操作成本低、溶劑消耗少、易再生等優點，能夠不破壞多糖的結構和生物活性而同時去除粗多糖提取物中的蛋白質。

離子交換樹脂，由于離子交換樹脂對多糖的吸附性不強，而蛋白質是兩性物質，可通過調節溶液pH值，使蛋白質處于離子狀態，使其吸附性增大。例如：在堿性條件下蛋白以陰離子形式存在，吸附在陰離子樹脂上；在酸性條件下其以陽離子形式存在，在陰離子樹脂上的吸附性顯著降低，因此，可通過改變酸度將蛋白質從陰離子樹脂上洗脫下來。但當樹脂的吸附能力降低時，須對樹脂進行再生。

1.2 樹脂對脫蛋白影響因素

大孔吸附樹脂對于中藥多糖的脫蛋白率有6大主要影響因素：

（1）pH值pH值通常通過改變多糖溶液中蛋白質和多糖的解離狀態來影響樹脂的吸附效率。

（2）溫度 吸附溫度是影響樹脂法脫蛋白效果的重要因素。升高溫度可以使溶質分子的熱運動增加，有利于蛋白質的吸附，但升到一定溫度下，吸附會達到飽和。因此，要選擇合適的吸附溫度。

（3）處理間 延長吸附時間可以提高樹脂對蛋白質的吸附，從而提高其脫蛋白率。然而，較長的吸附時間也會導致多糖的損失。

（4）樹脂用量 很明顯，樹脂柱的高徑比代表了樹脂柱床體積，隨著體積的增大，樹脂與蛋白質的交換能力增加，但交換能力最終會達到飽和。

（5）多糖溶液濃度 當多糖溶液濃度增大時，樹脂吸附會達到飽和。

（6）流速 隨著流速的增加，脫蛋白率會逐漸降低，緩慢的流速有利于蛋白在樹脂上的顆粒擴散和膜擴散，從而與樹脂進行離子交換。另外，近15年來諸多學者采用了多種不同的樹脂材料對中藥多糖脫蛋白效果進行測試（部分樹脂物理結構參數見表1），結果表明，每種樹脂材料的物理性質和化學吸附性質也同時決定了脫蛋白效率。

表1 部分樹脂的物理結構參數Tab.1 Physical structure parameters of part of resins

2 樹脂在中藥多糖脫蛋白中的應用

2.1 植物多糖

2.1.1 根及根莖類多糖 丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza的干燥根和根莖，丹參多糖具有免疫增強作用，湯偉等人[1]為了精制丹參多糖去除蛋白，對4種大孔吸附樹脂純化多糖效能進行了比較，篩選出DB-301型樹脂脫蛋白效果較好，脫蛋白率高達97.90%，而且多糖純度可達80%左右。人參為參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根莖，人參多糖可抗腫瘤，其增強免疫功能較強，陳巧巧等人[2]用靜態吸附去除人參多糖中蛋白質，從5種樹脂中篩選出JK008型陽離子交換樹脂最為有效，在此基礎上優化了動態吸附條件如下：上柱重量（藥材∶干樹脂）設置為1∶1，直徑高度比設置為1∶7，洗脫量為3BV。最終可使蛋白脫除率達到84.38%，糖醛酸保留率為84.90%。西洋參為五加科植物西洋參Panax quinquefolium的干燥根，西洋參多糖具有抗炎、免疫調節等多種活性，Yu等人[3]在分離純化西洋參多糖的過程中，將10mg·mL-1的西洋參多糖溶液經聚酰胺樹脂柱色譜（20g）（Φ16mm×300mm）洗脫，蛋白去除率為95.42%，多糖損失率為10.86%，結果顯示，聚酰胺樹脂柱法優于其它3種除蛋白方法Sevag法、TCA法和木瓜蛋白酶法。恰瑪古為Brassica rapa維族醫藥常用中藥，主要藥用部位為肉質塊根，具有滋陰潤肺等功效，陳卓爾等人[4]通過靜態吸附和動態吸附對比和篩選了9種樹脂對恰瑪古粗多糖的脫色脫蛋白作用，結果表明，采用HPD500型樹脂，多糖濃度1%，以流速3.6BV·h-1進行洗脫，0.75BV為上樣量，多糖保留率、脫色率、蛋白質脫除率3項綜合評分相對較高。

2.1.2 莖類多糖 紅心火龍果莖為仙人掌科量天尺屬植物哥斯達黎加量天尺Hylocereus costaricensis的莖，火龍果莖多糖，具有美白等多種活性，馬若影等人[5]經6種樹脂的篩選，認為其中AB-8型樹脂對紅心火龍果莖多糖的蛋白去除效果最佳，以樹脂的用量0.6g·mL-1，溫度60℃，pH值為5及時間2h為條件，脫蛋白最優，去除率可達88.29%，此時多糖保留率為83.47%。Shi等人[6]應用一種含有α-氨基膦酸鹽基團的Zn2+金屬離子熬合樹脂（LKC100型樹脂），對香蒲科植物水濁香蒲Typha angustifolia L.假莖多糖中的蛋白進行去除，吸附洗脫條件為：粗多糖濃度1.5mg·mL-1，吸附時間30min，初始pH值為7.0，吸附溫度30℃，流速1.5BV·h-1，樹脂柱的徑高比為1∶15。此條件下，香蒲多糖中蛋白去除率和多糖保留率分別為（69.20±0.62）%和（87.50±0.76）%。

2.1.3 葉類多糖 枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica的干燥葉，近期研究表明，枇杷葉多糖具有抗氧化作用，戴婉妹等人[7]從6種樹脂中篩選出ADS-7型樹脂去除枇杷葉多糖中的蛋白最佳，采用10%乙醇洗脫回收多糖，此條件下多糖的解析率為69.65%，再用95%乙醇洗脫蛋白質，蛋白解析率為89.58%，此外，此方法還可將ADS-7型樹脂再生利用。普洱茶為山茶科植物普洱茶Camellia sinensis的葉，普洱茶多糖具有增強免疫、降血糖、降血脂等功能，楊新河等人[8]篩選了10種樹脂，其中D101型樹脂對普洱茶多糖中色素和蛋白質的吸附能力較強，經靜態吸附單因素試驗和正交試驗，4因素最佳條件為：溫度50℃、樹脂用量11mL、pH值為4.0、料液質量濃度3.8mg·mL-1。此條件普洱茶多糖中蛋白去除率可達70.89%。淫羊藿為小檗科植物淫羊蕾Epimedium brevicornu的干燥葉，淫羊藿多糖被發現有改善小鼠學習記憶障礙的作用，李瑞軍等人[9]從淫羊藿多糖中蛋白去除效果上，ADS-7型樹脂明顯優于其他3種大孔吸附樹脂，淫羊藿粗多糖溶液為18.59mg·mL-1，pH值為5.0，v=1.5BV，洗脫體積控制在2倍柱體積，該方法具有較高的去除效率，蛋白含量由1.2%下降到0.035%。

2.1.4 果實類多糖 無梗五加為五加科五加屬植物Eleutherococcus sessiliflorus的果實，無梗五加果多糖具有抗疲勞等多種藥理活性，馮穎等人[10]為了脫除無梗五加果粗多糖中蛋白，考察了4種大孔吸附樹脂，認為HPD-400型樹脂優于其他3種，且當條件設置為上樣量和洗脫劑用量均為2個柱床體積（20mL）時，HPD-400型樹脂蛋白去除率可達89.37%，多糖含量由原來的20.5%提高到83%。現代研究表明，無患子科植物龍眼Dimocarpus longan多糖具有抗氧化、保肝等功能，易陽等人[11]從兩種陰離子交換樹脂和6種大孔吸附樹脂篩選出陰離子交換樹脂D301-F型樹脂，對龍眼多糖中蛋白的去除效果最好，多糖溶液質量分數4%，料液比0.16g·mL-1，pH值為5，溫度為50℃，此時蛋白質去除率為73.12%，多糖保留率為85.75%。藍海波等人[12]考察了7種樹脂，結果表明，D301-R型樹脂在溫度為48℃，pH值為5.0，樹脂用量為0.61g·mL-1及時間為2.0h的條件下，龍眼多糖蛋白去除率為91.83%，明顯優于其他6種樹脂。

2.1.5 種子類多糖 銀杏果是銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba）種子，楊強等人[13]從6種大孔吸附樹脂和兩種離子交換樹脂篩出脫色1號樹脂對銀杏果多糖的脫蛋白效果最好，在最優的條件下（pH值為4.5，溫度為25℃，上柱速度為1.5mL·min-1，上樣濃度為4mg·mL-1，柱容量為2BV），蛋白去除率為88.39%，多糖保留率為79.12%。狀元豆為豆目蝶形花亞科大萊豆Phaseolus limensis，具有祛濕、補血等功效，黎英等人[14]從10種樹脂中，篩選出D113型樹脂對狀元豆粗多糖除蛋白效果最佳，在室溫25℃下，上樣濃度為4.1mg·mL-1，pH值為5.5，流速為1.6mL·min-1，上樣體積為2.9BV時，蛋白去除率和多糖保留率分別達（90.24±0.87）%和（94.07±1.15）%。使用后用30%乙醇洗脫液洗脫可讓樹脂再生。

2.1.6 花類多糖 款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara的干燥花蕾，款冬花多糖可抑制白血病細胞，Zhao等人[15]靜態吸附實驗考察5種樹脂，LS-206型樹脂對款冬花多糖的脫色率高于其他樹脂，再通過動態吸附曲線，25℃溫度下，流速1.5BV·h-1，5mg·mL-1款冬花多糖用量為2BV，在此條件下，款冬花多糖的蛋白去除率為91.42%，多糖回收率為85.38%。宋逍等人[16]通過靜態試驗從5種樹脂中再次確定LS-206型樹脂對款冬花多糖脫除蛋白效果最好，動態吸附條件為：上柱高徑比15，溫度30℃，上柱體積2BV，多糖溶液濃度6mg·mL-1，上柱速率1.5BV·h-1。此條件下的款冬花多糖的脫蛋白率為87.70%，多糖保留率為87.89%。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或帶初開的花，金銀花多糖具有抗菌等活性，何俊婷[17]為了對金銀花多糖進行純化脫除雜質，對比7種大孔吸附樹脂，并最終篩選出LS-206型樹脂進行除雜，上樣濃度為3mg·mL-1，上樣量為1.4BV，流速設置為1.5BV·h-1，在此條件下，金銀花多糖脫蛋白率為83.83%，多糖保留率為81.29%。

2.1.7 皮類多糖 厚樸為木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸Magnolia officinalis的干燥干皮、根皮及枝皮，厚樸多糖具有一定抗抑郁活性，藍閩波等人[18]從6種大孔吸附樹脂中，通過靜態吸附法篩選出ADS-7型大孔樹脂對厚樸多糖的效果最佳，ADS-7屬強極性樹脂，對0.1%厚樸粗多糖的脫蛋白率能達到91%。

2.1.8 全草類多糖 二色補血草為白花丹科植物二色補血草Limonium bicolor的帶根全草，二色補血草多糖可抑制hela細胞體外生長，Zhang等人[19]為了去除二色補血草多糖中的蛋白，從5種不同樹脂中篩選出LX-46型樹脂效果最好，經進一步條件優化，各參數設置為：流速1.5BV·h-1，上樣量2BV，室溫下多糖樣品溶液濃度6mg·mL-1，此條件下，蛋白去除率達92.79%，同時多糖的保留率為86.53%。

2.1.9 殘渣及壓榨物類多糖 葫蘆科植物南瓜Cucurbita moschata多糖具有體外抑菌等活性，Yang等人[20]比較了6種不同極性、直徑和表面的樹脂，對南瓜多糖溶液進行脫蛋白試驗，篩選出S-8型樹脂效果最好，經動態吸附和解吸測試，S-8型樹脂最佳吸附條件為：粗多糖溶液濃度1mg·mL-1；處理量2BV；流速1mL·min-1；溫度20℃。S-8型樹脂最佳解吸條件：8BV的NaCl溶液（50mM，pH值7.0）和8BV的乙醇-水（70∶30，v/v）作為洗脫液，流速為1mL·min-1。此條件下，脫蛋白率為（75.9±0.9）%，多糖保留率為（84.7±1.2A）%，綜合效用優于H2O2和Sevage試劑法。紫蘇子為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens的干燥成熟果實，紫蘇籽制取紫蘇籽油后的主要加工副產物即為紫蘇粕，紫蘇粕多糖具有抗氧化活性，朱建飛等人[21]通過靜態吸附測試，認為D101型樹脂優于其他7種大孔吸附樹脂，可以使紫蘇粕多糖提取液的脫蛋白效果最大，動態吸附試驗顯示D101型樹脂動態吸附中對于多糖的回收率為88.43%，高于其他樹脂。

2.2 菌類多糖

香菇為真菌類擔子菌綱傘菌目傘菌科香蕈Lentinus edodes，以子實體入藥，具有抗腫瘤等功效，肖靜怡等人[22]對香菇多糖的脫蛋白效果進行了考察，篩選了717型陰離子樹脂、JK008型陽離子樹脂和AB-8型大孔樹脂3種類型樹脂，其中脫蛋白效率JK008型＞717型＞AB-8型，陽離子交換樹脂JK008可使香菇多糖脫蛋白率達到86.5%，多糖的保留率達到85%，且條件溫和。桑黃為多孔菌科植物針層孔Phellinus igniarius的子實體，可顯著提高人體免疫，秦俊哲和張慧洋[23]通過靜態吸附篩選出D-101-I型樹脂去除桑黃粗多糖的蛋白最好，優于其他4種大孔吸附樹脂，動態吸附實驗確定最佳條件為：室溫下，多糖液濃度300mg·mL-1，流速1mL·min-1，上樣量為2BV時蛋白的吸附率達90%；乙醇濃度為50%，用量為2BV時，蛋白脫除率達83.9%，多糖損失率為25.1%。赤靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum的干燥子實體，赤靈芝多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗皰疹等多種生物活性，Jiang等人[24]從不同類型的離子交換樹脂中，綜合考慮對赤靈芝多糖蛋白的去除率和赤靈芝多糖的回收率，最終篩選出A103S型陰離子交換樹脂效果最佳，經過響應面法優化各因素水平，確定最優條件為：樣品濃度10mg·mL-1，樣品體積100mL，樣品流速2mL·min-1，洗脫流速40mL·min-1。此條件測試結果，赤靈芝多糖蛋白去除率和多糖回收率為88.52%和85.06%。

2.3 其他類多糖

蟲白蠟為介殼蟲科昆蟲白蠟蟲Ericerus pela的雄蟲，群棲于木犀科植物白蠟樹、女貞或女貞屬他種植物枝干上分泌的蠟精制而成，蟲白蠟多糖具有抗氧化免疫等功效，何釗等人[25]從12種不同結構參數的大孔吸附樹脂中，優選篩出NKA-9型樹脂對于蟲白蠟多糖中蛋白的去除率最好，吸附條件優化為pH值為8.0，溫度為30℃，蟲白蠟多糖溶液濃度為10mg·mL-1，以1BV·h-1流速上樣1BV后，以5BV水洗脫，此時脫蛋白率為51.9%、多糖回收率為60%。

3 結論

到目前為止，多糖脫蛋白技術已被學術界廣泛研究，采用了除樹脂外的多種方法，包括廣泛使用的Sevag法、三氯乙酸法、凍融（FTT）法。然而，Sevag法和三氯乙酸法都是化學試劑，有毒且難以放大，并且需要復雜和多步驟的過程，導致脫蛋白率低，多糖損失大，甚至可能降低多糖的生物活性。雖然凍融脫蛋白無毒，但需要耗費時間和熱量。然而，樹脂脫蛋白法保留了多糖的特征官能團、單糖組成和分子量。重要的是，樹脂脫蛋白不消耗任何有毒的有機試劑。樹脂是一種對環境友好的多糖脫蛋白方法，有望在未來取代常用的Sevag法等傳統方法，而被廣泛應用。