HPLC法測定蘋果中游離糖組成及含量*

許海菊，李玉紅

（咸陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 咸陽712000）

隨著人們生活質(zhì)量的提高，與日常生活息息相關(guān)的日用品、食物、水果中的一些營養(yǎng)物質(zhì)的含量也是人們關(guān)注的焦點之一，因為糖類與人們的生活和健康有著密不可分的關(guān)系，所以對于水果中糖類含量的檢測是非常有必要的。蘋果在我國境內(nèi)有大面積的種植，已成為最受歡迎的水果之一[1]。蘋果果肉含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)成分對人體健康具有重要作用，深入了解蘋果果實中游離糖的種類以及含量，有助于提高人們對蘋果的認(rèn)知與重視程度，改變不良飲食習(xí)慣與消費習(xí)慣[2]。目前，關(guān)于游離糖測定方法有很多種，比如，酶電極法[3]、氣相色譜法[4]、化學(xué)分析法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜法[7]等，而高效液相色譜法相比于其他幾種方法具有很多優(yōu)點[8]，所以此次實驗將采用高效液相色譜法來分別測定咸陽蘋果、黃蘋果、青蘋果、洛川蘋果和蛇果這5種蘋果果實中的游離糖種類以及各自的糖含量，比較分析每種蘋果中蔗糖、果糖、葡萄糖的含量，為不同的人群提供合理選擇蘋果的理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 藥品試劑與儀器設(shè)備

果糖、蔗糖、葡萄糖、乙腈，均為分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠；無水甲醇、無水乙醇，均為分析純，上海化學(xué)試劑廠；蛇果，黃蘋果，青蘋果，洛川蘋果，咸陽蘋果（市售）。

LC10Avp型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Arium-61L型超純制水機（德國Sartorius公司）；SEDEX75型蒸發(fā)光散射檢測器（法國Dikma公司）。

1.2 樣品處理及溶液的配制

用超純水分別將咸陽蘋果、黃蘋果、青蘋果、蛇果和洛川蘋果清洗干凈，進(jìn)行削皮、去芯后用分析天平稱量咸陽蘋果141.8035g，黃蘋果95.2406g，青蘋果137.8853g，蛇果97.8156g，洛川蘋果100.3615g。分別加入20mL超純水，放入干凈的榨汁機中榨汁。用移液槍吸取一定量的每種樣品汁液3份于100mL的容量瓶中，進(jìn)行30min超聲處理。定容，搖勻，離心，時間約為15min。將離心管中的上清液用一次性醫(yī)用針管吸取一定質(zhì)量，用0.45μm的過濾膜過濾，將濾液置于試劑瓶中并編號用于高效液相色譜分析測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取蔗糖804.4g、葡萄糖701.3g、果糖699.0g置于同一燒杯中；加適量的超純水使固體全部溶解；將所得的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中定容，搖勻，用移液槍將上述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別移取0.5、1、2、3、4mL于5個25mL的比色管中，用超純水定容。按照最佳色譜條件進(jìn)樣測試，在顯示器上讀出每一個樣品在色譜圖中的峰面積，根據(jù)每種游離糖的峰面峰面積和濃度的對應(yīng)關(guān)系計算線性回歸方程，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相配比的選擇

當(dāng)乙腈-水的體積比為60∶40和70∶30時，色譜圖上只出現(xiàn)果糖和葡萄糖的峰并沒有出現(xiàn)蔗糖的峰，因此，這兩種配比不滿足實驗要求，只有當(dāng)乙腈-水的體積比為80∶20時，在色譜圖中出現(xiàn)果糖、葡萄糖、蔗糖的3個峰。

圖2 流動相配比對游離糖測定的影響Fig.2 Effect of flow matching ratio on determination of free sugar（1.fructose 2.glucose 3.sucrose）

2.2 最佳柱溫的選擇

圖3 柱溫對游離糖測定的影響Fig.3 Effect of column temperature on determination of free suga

為了使樣品中3種游離糖有更好的分離效果，必須選擇一個最佳的柱溫來對樣品進(jìn)行檢測。選擇溫度梯度設(shè)置為20、30、40、50和60℃，在此溫度梯度條件下對樣品溶液進(jìn)行測定，通過測定柱溫為50℃時，3種游離糖可以完全分離且分離效果好。

2.3 流動相流速的選擇

本次實驗將流速梯度設(shè)定為0.4、0.6、0.8和1mL·min-1。經(jīng)過實驗對比發(fā)現(xiàn)在流速為1mL·min-1時3種峰能夠完全分離。

圖4 流速對游離糖測定的影響Fig.4 Effect of flow velocity on the determination of free sugar

2.4 精密度的測試

精密度是指在相同條件下，多次測定同一樣品[9]。在最佳色譜條件下，對同一樣品多次測定，采用峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示精密度[10]。計算得知：果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.91%、2.38%、2.54%。

表1 平行測定峰面積數(shù)據(jù)Tab.1 Parallel determination of peak area data

2.5 樣品定性分析

根據(jù)3種糖的保留時間不同，將混合標(biāo)樣色譜圖與3個單糖的色譜圖分別進(jìn)行比較，可知第一個出峰的是果糖，第二個出峰的是葡萄糖，第三個出峰的是蔗糖。

圖5 標(biāo)樣色譜圖Fig.5 Chromatogram of sample

圖6 黃蘋果色譜圖Fig.6 Chromatogram of Yellow apple

圖7 青蘋果色譜圖Fig.7 Chromatogram of Green apple

圖8 蛇果色譜圖Fig.8 Chromatogram of snake fruit

圖9 洛川蘋果色譜圖Fig.9 Chromatogram of Luochuan apple

圖10 咸陽蘋果色譜圖Fig.10 Chromatogram of Xianyang apple

2.6 蘋果樣品中游離糖的含量分析

根據(jù)果糖、葡萄糖、蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和各自的平均峰面積可以求出樣品溶液中總含糖量[11]，再根據(jù)樣品溶液總含糖量便可求出5種蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。

表2 蘋果中各種游離糖的含量（g·100g-1）Tab.2 Contents of various free sugars in apples（g·100g-1）

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜法，在色譜柱為氨基色譜柱，流動相為乙腈-水，其體積比為20∶80，流速1mL·min-1，柱溫50°C，進(jìn)樣量20μL，N2壓強3.5bar，提取劑為超純水的條件下，測得蘋果果實中的可溶性游離糖主要為果糖、葡萄糖、蔗糖。從實驗數(shù)據(jù)中可得出：青蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分別為7.83%、4.47%、1.69%；黃蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分別為6.67%、3.34%、1.27%；蛇果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分別為10.52%、4.58%、1.91%；洛川蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分別為12.52%、4.657%、1.123%；咸陽蘋果中果糖、葡萄糖、蔗糖含量分別為9.47%、3.87%、2.94%。本次實驗所選的蘋果中，果糖含量最高，其次是葡萄糖，最少的是蔗糖。經(jīng)計算洛川蘋果中的總糖含量是最高的，黃蘋果中糖含量是最低的。其他的3種蘋果中糖含量差距不大。經(jīng)過此次實驗的測定可以得出各種蘋果的含糖量，為人們在身體狀況不同時提供更好的選擇依據(jù)，也可為其他的水果研究提供一定的參考價值。