蛋白激酶C 在機械牽張致肺上皮細胞損傷中的作用＊

劉孟潔，谷長平，王月蘭

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、急性呼吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS） 是由各種非心源性原因導致的肺毛細血管內皮和肺泡上皮細胞損傷，血管通透性增高的臨床綜合征，表現為急性、進行性加重的呼吸困難，難治性低氧血癥和肺水腫［1］。 ALI 和ARDS 是一個動態變化的復雜的臨床綜合征，是嚴重損傷引起機體全身免疫炎癥反應失控過程中的不同階段。

機械通氣誘發肺損傷（ventilation induced lung injury，VILI） 的基本機制為肺組織過度牽拉的機械因素和機械力學誘導的肺臟局部細胞因子和炎癥介質的釋放［2］，肺泡膜的完整性破壞及通透性增加是根本原因。 細胞連接蛋白是維持黏膜上皮機械屏障和通透性的重要結構，主要包括Zo-1、Claudin 和Occludin 蛋 白 等［3］，其 中occludin 是 最 早 被 發 現 的組成緊密連接（tight junction，TJ）最主要的成分。 蛋白激酶C（PKC）是一種磷脂依賴的絲/蘇氨酸激酶，有研究表明在occludin 蛋白功能的調節中，絲/蘇氨酸的磷酸化狀態較為重要。

1 材料與方法

1.1 標本采集 小鼠肺上皮細胞MLE-12（上海中國科學院細胞庫），Flexcell 細胞應力加載系統FX-5000TM 及BioFLEX○R雙向應力細胞培養板（Flexcell公司， 美國）， 兔抗大鼠Occludin 多克隆抗體、DMEM/F12 胎牛血清（Invitrogen 公司，美國），蛋白激酶C（PKC）抑制劑BisindolylmaleimideⅠ（批號：133052-90-1，Cayman 公司，美國），二甲基亞砜（批號：0231，Amresco 公司，美國），二氧化碳培養箱，超凈工作臺，Tanon-4500SF 全自動數碼凝膠化學發光圖像分析系統由山東省千佛山醫院實驗研究中心提供。

MLE-12 細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養基中，在37 ℃、5%CO2的條件下培養，傳代至穩定。 牽張前將MLE-12 細胞以1×105個/cm2的密度接種到Bio FLEX 彈性膜細胞培養板靜置培養24～48 h， 再使用無血清培養基饑餓處理2 h。 機械牽張組采用Flexcell 5000TM 牽張細胞，參照文獻［4］的方法，將Bio FLEX 培養板放入牽張儀，壓緊保證其密閉，分別施加不同牽張力使彈性膜拉伸8%和20%，牽張頻率0.5 Hz，牽張時間分別為0 h、1 h、2 h、4 h； 之后再將MLE-12 細胞隨機分為3 組：牽張組（C 組）、二甲基亞砜對照組（D 組）和PKC 抑制劑BIM 組（B 組），牽張前1 h；D 組和B組分別加入二甲基亞砜）30 μl/ml 和PKC 抑制劑BisindolylmaleimideⅠ5 μmol/L（用二甲基亞砜溶解）處理細胞，采用20%的強度牽張4 h，頻率0.5 Hz。牽張完成后將培養板置于顯微鏡下觀察拍照。 之后取出Bio FLEX 培養板，PBS 沖洗，胰酶消化后離心取沉淀， 加充分裂解后，12000×g 離心5 min 取上清，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對肺組織上清定量，加樣于10%SDS-PAGE 進行電泳（80 V，30 min；120 V，60 min），濕轉至PVDF 膜（280 mA，60 min），5%的脫脂奶粉37 ℃封閉60 min，分別加入Occludin多克隆抗體（1∶250）和內參GAPDH 一抗（1∶3000），4 ℃孵育過夜， 洗膜后加入辣根酶標記的二抗 （1∶5000）37 ℃雜交60 min，洗膜后用ECL 化學發光法檢測陽性信號，Tanon-4500SF 全自動數碼凝膠化學發光圖像分析系統觀察，用軟件對圖像條帶進行灰度掃描，計算積分吸光度值。 以積分吸光度值反映肺組織occludin 蛋白的表達水平。

1.2 統計學分析 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠肺上皮細胞不同牽張時間點occludin 蛋白的表達 機械牽張導致小鼠肺上皮細胞表面的細胞連接蛋白occludin 的表達減少，呈時間和強度依賴性。 在機械牽張不同時間0 h、1 h、2 h、4 h，牽張強度8%occludin 蛋白表達為0.934±0.011、0.711±0.063、0.644±0.037、0.539±0.016， 牽張強度20%occludin 蛋白表達為0.913±0.008、0.692±0.048、0.571±0.039、0.307±0.066；可見，隨著時間的延長，occludin 蛋白表達逐漸減少，20%的牽張強度牽張4 h 時occludin 蛋白減少最明顯。

2.2 3 組MLE-12 細胞不同時點0ccludin 蛋白表達比較 3 組細胞隨機械牽張時間的延長，occludin蛋白表達逐漸下調（P<0.05）；與C 組比較，D 組各時點occludin 蛋白表達差異無統計學意義 （P>0.05），B 組機械牽張2 h、4 h 時occludin 蛋白表達上調（P<0.05），見表1。

2.3 20%牽張強度牽張4 h 后小鼠肺上皮MLE-12 細胞的形態改變 牽張前對照組的細胞形態正常， 成橢圓形貼壁生長， 細胞連接較緊密， 而以20%的牽張強度牽張4 h 后（C 組、D 組）觀察發現細胞形態不規則，呈分支狀、桿狀，細胞有較多脫落，貼壁不緊，細胞間連接不夠緊密，此時的肺損傷也最嚴重， 使用BIM 處理后細胞損傷減輕（B組），見圖1。

表1 3 組MLE-12 細胞不同時點occludin 蛋白表達比較（n=3，±s）

表1 3 組MLE-12 細胞不同時點occludin 蛋白表達比較（n=3，±s）

注：與0 h 比較，＊P＜0.05；與1 h 比較，#P＜0.05；與2 h 比較，△P＜0.05；與C 組比較，▲P<0.05。

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圖1 3 組周期性牽張4 h 后小鼠肺上皮MLE-12 細胞的形態改變（光鏡，×400）

3 討 論

機械通氣誘發肺損傷（ventilation induced lung injury，VILI） 是指應用呼吸機過程中由于機械通氣諸多因素和肺部原發病共同作用導致的肺組織損傷。 以往對機械通氣的研究主要集中在吸入高濃度氧氣的毒性效應上。 但是近期的實驗研究顯示，高容量和高壓力機械通氣亦可造成肺損傷，導致非損傷肺區發生高通透性肺水腫而已損傷肺區的水腫加重［5］。 肺泡膜的完整性破壞及通透性的增加是各種原因導致的急性肺損傷肺水腫形成的根本原因。機械通氣誘發肺損傷在臨床上表現為進行性呼吸窘迫和頑固性低氧血癥， 進而誘發多器官功能障礙，導致患者死亡。VILI 的發病機制錯綜復雜，至今沒有統一定論，而筆者在之前的動物實驗研究中探討了VILI 的發病機制［6］，因此該實驗通過對小鼠肺上皮細胞（MLE-12 細胞）進行機械牽張模擬臨床呼吸機進行機械通氣，研究機械牽張過程中細胞連接蛋白occludin 的表達變化， 從而明確occludin 蛋白及蛋白激酶C（PKC）在機械通氣誘發肺損傷中的作用。

Occludin 是第一個被發現的定位于緊密連接的跨膜蛋白，而緊密連接位于上皮細胞頂端相鄰細胞間，在維護上皮細胞兩側物質的差異和保持細胞極性以及結構的穩定上起著重要作用［3］。 Occludin蛋白作為緊密連接蛋白的重要組成成分，在維持肺泡黏膜上皮機械屏障的完整性與細胞通透性方面起著重要作用［7］。該研究結果表明，機械牽張小鼠肺上皮MLE-12 細胞，occludin 蛋白的表達減少呈時間和強度依賴性， 分別使用8%和20%的牽張強度對MLE-12 細胞進行周期性牽張，occludin 蛋白有不同程度的表達減少，20%的牽張強度occludin 蛋白明顯減少；且隨著牽張時間的延長表達減少更明顯，20%牽張4 h 組occludin 蛋白減少程度最明顯，且肺損傷表現更嚴重。 顯微鏡下發現MLE-12 細胞水腫，形態不規則，呈分支狀、桿狀，細胞有較多脫落，貼壁不緊，細胞間連接不夠緊密，間隙增加。

有研究表明黏附連接蛋白p120 的減少也會導致肺水腫肺損傷的加重，其機制可能是機械通氣過程中激活了蛋白激酶Src［9］，而之前的研究發現PKC可能通過下調occludin 的表達而參與機械通氣相關性肺損傷的發生［10，11］，因此筆者使用PKC 抑制劑BIM 預處理牽張的細胞，以研究在周期性牽張過程中PKC 對occludin 蛋白的影響以及occludin 蛋白的表達改變對肺損傷的影響。蛋白激酶C 是一族依賴于Ca2+、磷脂或二酰甘油刺激而激活，催化絲/蘇氨酸殘基磷酸化的蛋白激酶， 廣泛分布于多種組織、器官和細胞，BIM 是一種高選擇性、膜通透的、可逆的PKC 抑制劑［12］。 實驗發現與正常對照組比較，20%的強度周期性牽張MLE-12 細胞4 h 后，occludin 蛋白表達明顯減少， 而BIM 預處理阻斷PKC 后，occludin 蛋白表達上調，肺損傷減輕，提示周期性機械牽張激活PKC 下調occludin 的表達，從而使肺泡之間的致密連接受損，引起肺泡膜的完整性破壞和通透性的增加，導致急性肺水腫，表明由于蛋白激酶的激活導致的occludin 的表達下調了參與大鼠機械通氣肺損傷的病理生理過程。

綜上所述， 機械牽張可下調小鼠肺上皮細胞occludin 蛋白表達， 呈時間依賴性及強度依賴性，PKC 抑制劑減輕occludin 的下調從而緩解肺損傷，因此認為蛋白激酶C 可能參與機械通氣誘發肺損傷的發生。