芒柄花黃素對人腎癌細胞786-O 的抑制作用及機制研究

陳 慶 李海虹 歐偉寧 張 幸

1.廣西壯族自治區玉林市第二人民醫院腎內科，廣西玉林 537000；2.廣西壯族自治區玉林市第一人民醫院質控科，廣西玉林 537000；3.桂林醫學院廣西腫瘤免疫與微環境調控重點實驗室，廣西桂林 541100

腎癌惡性程度較高，化療、放療效果不好，且近幾年國內外發病率呈上升趨勢[1-2]。芒柄花黃素是一種異黃酮類植物雌激素，其能調節分子信號通路對腫瘤產生抑制作用[3-5]，但對人腎癌細胞786-O 的作用及機制卻未見報道。本實驗研究芒柄花黃素對786-O 細胞的抑制作用及機制，為腎癌的治療尋找新的藥物及思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人腎癌細胞株786-O 購于中國科學院上海生命科學研究院；芒柄花黃素（貨號：47752-25MG-F）購于美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養基、胎牛血清購于美國Hyclone 公司；CCK8 試劑盒（貨號：C0038）、Hoechst33258（貨號：C1018）、V-FITC 凋亡檢測試劑盒（貨號：C1062M）購于上海碧云天研究所；PI3K 抗體（貨號：PA5-86628）、P-PI3K 抗體（貨號：PA5-38905）購于美國Thermo Scientific 公司；AKT（貨號：sc-5298）、P-AKT抗體（貨號：sc-377556）購于美國Santa Cruz 公司；CFX96 熒光定量PCR 儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統購于美國Bio-Rad 公司；FACSAria Ⅲ流式細胞儀購于美國Becton Dickson 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 786-O 細胞于37℃、5%CO2的培養箱中，用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養基培養。

1.2.2 細胞分組 根據加入到786-O 細胞中的芒柄花黃素劑量（0、20、40、80 μmol/L）分為對照組（A 組）、芒柄花黃素低劑量組（B 組）、芒柄花黃素中劑量組（C 組）、芒柄花黃素高劑量組（D 組）。

1.2.3 CCK8 法檢測細胞增殖情況 取對數生長期的786-O 細胞接種于96 孔板，濃度為5×103個/孔，加藥分組，每組設3 個復孔。分別培養24、48、72 h 后，加10 μL CCK8 溶液避光孵育2 h，用酶標儀測吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率=（1-藥物組平均OD 值/對照組平均OD 值）×100%。實驗重復3 次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取對數生長期的786-O 細胞接種于6 孔板，孵育12 h，待細胞貼壁，去上清液，分別加入0、20、40、80 μmol/L 濃度的藥液，繼續孵育48 h，胰酶消化成單細胞懸液，PBS 清洗3 次，2000 r/min 離心5 min，離心半徑12 cm，棄上清液，加500 μL 結合緩沖液重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC及5 μL Propidium Iodide 混勻，在室溫避光反應15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3 次。

1.2.5 Hoechst 染色觀察細胞凋亡情況 取對數生長期的786-O 細胞接種于6 孔板，孵育12 h，待細胞貼壁，去上清液，分別加入0、20、40、80 μmol/L 濃度的藥液，繼續培養48 h 后棄培養基，加入0.5 mL 的固定液，作用10 min 后棄固定液，PBS 清洗2 次，加Hoechst33258染色液觀察細胞凋亡情況。

1.2.6 RT-PCR 檢測miR-155 的表達情況 Trizol 提取總RNA，按照試劑盒說明書逆轉錄總RNA 為cDNA，以cDNA 為模板用RT-PCR 檢測miR-155 表達情況。miR-155 上游引物：5’-TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3’，下游引物：5’-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3’。U6 上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應條件為：預變性95℃5 min；循環以下條件40 次：95℃30 s，60℃25 s，72℃15 s。以U6 RNA 為內參，計算miR-155 的相對表達量。

1.2.7 Western blot 檢測P-PI3K 及P-AKT 蛋白表達情況 收集上述幾種濃度的藥液孵育48 h 后的786-O 細胞，BCA 法進行蛋白定量。每孔20 μL 上樣，電泳4 h，PVDF 膜半干轉1.5 h，用5%脫脂奶粉的PBS液室溫封閉60 min，之后分別加入稀釋度1∶1000 的PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT 抗體4℃過夜，次日TBS洗膜，HRP 標記的二抗室溫反應60 min，置暗室曝光條帶。凝膠成像分析系統分析蛋白條帶的光密度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，不同時間點比較采用重復測量方差分析，兩兩比較用LSD-t 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組細胞不同時間的增殖抑制率比較

整體分析發現：四組時間、組間比較，差異有統計學意義（P <0.05）；交互作用比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示藥物對786-O 細胞具有抑制作用。組內比較發現：培養72 h，B、C、D 組細胞增殖抑制率高于培養24、48 h；培養48 h，B、C、D 組細胞增殖抑制率高于培養24 h，差異均有統計學意義（均P<0.05）。組間比較發現：培養24、48、72 h，B、C、D 組細胞增殖抑制率高于A 組，C、D 組細胞增殖抑制率高于B 組，D 組細胞增殖抑制率高于C 組，差異均有統計學意義（均P <0.05）。見表1。

表1 四組細胞不同時間的增殖抑制率比較（%，，n=3）

表1 四組細胞不同時間的增殖抑制率比較（%，，n=3）

注：與A 組同期比較，*P＜0.05；與B 組同期比較，▲P＜0.05；與C 組同期比較，■P＜0.05；與本組24 h 比較，◆P＜0.05；與本組48 h 比較，★P＜0.05

2.2 四組細胞凋亡率比較

四組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P <0.05）；B、C、D 組細胞凋亡率高于A 組，C、D 組細胞凋亡率高于B 組，D 組細胞凋亡率高于C 組，差異均有統計學意義（均P <0.05）。見表2。Hoechst 染色結果顯示，B、C、D 組可見細胞皺縮，細胞核致密濃染，且藥物劑量越高，細胞凋亡越明顯；A 組細胞核完整，形態飽滿。見圖1。

表2 四組細胞凋亡率比較（%，，n=3）

表2 四組細胞凋亡率比較（%，，n=3）

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，▲P＜0.05；與C 組比較，■P＜0.05

圖1 各組細胞熒光顯微照片（400×）

2.3 四組細胞miR-155 表達水平比較

B、C、D 組細胞miR-155 表達水平低于A 組，C、D 組細胞miR-155 表達水平低于B 組，D 組細胞miR-155 表達水平低于C 組，差異均有統計學意義（均P <0.05）。見圖2。

圖2 四組細胞miR-155 表達水平比較（n=3）

2.4 四組細胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達水平比較

B、C、D 組細胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達水平低于A 組，C、D 組P-PI3K、P-AKT 蛋白表達水平低于B 組，D 組細胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達水平低于C 組，差異均有統計學意義（均P <0.05）。見圖3。

圖3 四組細胞P-PI3K、P-AKT 蛋白表達水平比較（n=3）

3 討論

化療及靶向治療腎癌近年來逐漸發揮重要作用[6]，而傳統化療藥物易產生毒副作用，破壞人體免疫系統，反而使癌細胞更易擴散[7-8]。有研究顯示[9-11]，芒柄花黃素能多靶點抑制腫瘤細胞增殖。本研究結果顯示，芒柄花黃素抑制786-O 細胞增殖；流式細胞術和Hoechst 染色均顯示藥物劑量越高，786-O 細胞凋亡率越高，與CCK8 實驗結果相符。提示藥物可能通過誘導細胞凋亡從而抑制786-O 細胞增殖。

miRNA 是一類通過誘導靶基因降解或阻斷其翻譯過程沉默該基因的表達進而對細胞分化、增殖、凋亡以及侵襲轉移起重要作用的小分子非編碼RNA[12-14]。隨著對microRNA 研究的深入，microRNA 被發現與腫瘤的發生、發展存在重大聯系[15-18]。miR-155 在大多數腫瘤例如結腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、腎癌中表達較高[19-23]，提示miR-155 作為癌基因過表達可促進細胞異常增殖。PI3K 是一種原癌基因，經活化后產生的PIP3 可使AKT 被激活產生磷酸化，從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡等進程[24]，因此PI3K/AKT 信號通路異常激活能促進細胞增殖并抑制細胞的凋亡[25]。研究顯示[26]，miR-155 能通過PI3K/AKT 通路促進腫瘤細胞的增殖，而下調miR-155 能抑制PI3K/AKT 通路的激活，明顯抑制細胞增殖。本研究結果顯示，芒柄花黃素能使miR-155 表達水平降低，P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT 比值降低，即PI3K/AKt 通路激活被抑制。提示芒柄花黃素抑制786-O 細胞增殖、誘導其凋亡的機制可能與其下調miR-155 表達，抑制PI3K/AKT 信號通路激活有關，本研究為腎癌的治療提供了新的思路和方法，具有重要研究價值。