LC-MS/MS內標法測定豬肝中3種β-受體激動劑藥物的不確定度分析

何國成，賈曉菲，何思聰，周婉儀，張益文

(中山市農產品質量安全檢驗所，廣東 中山 528437)

1 引言

β-受體激動劑屬于苯乙醇胺類藥物，也稱為β-腎上腺素能受體激動劑，醫學上常用于治療呼吸道疾病，同時其在生物體內還具有“再分配效應”，促進生物體內脂肪的分解，并為蛋白質合成提供有利條件，故俗稱“瘦肉精”。β-受體激動劑在臨床上用于人體劑量較低，但是一些動物飼養者有時會違法在動物飼料中添加大劑量的β-受體激動劑來提高牲畜瘦肉率和飼料轉化率[1]。動物攝入后主要蓄積在肝臟和腎中，人體攝入過量的β-受體激動劑會出現心率加快癥狀，進而加重心腦血管、糖尿病、冠心病等患者癥狀。為保證β-受體激動劑殘留量檢測結果的準確可靠，科學地描述整個實驗過程中檢測結果產生的誤差，按照 《檢測和校準實驗室能力的通用要求》中的規定，實驗室的每個證書或報告必須要有不確定評定的說明，以便規范實驗室管理，保證檢驗工作質量[2]。不確定度是與測量結果相關聯的參數，表征賦予被測量值的分散性，不確定度的評定在量值溯源方面具有重要意義[3]。本文采用《農業部1025號公告-18-2008》[4]檢測方法對豬肝中的沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺這3種β受體激動劑種類殘留量的不確定度進行評定，為檢驗結果的準確性及可靠性提供技術依據，同時也為其他實驗室采用內標法評定不確定度提供參考。

2 材料和方法

2.1 材料試劑

2.1.1 樣品

取陰性豬肝樣品，約200 g，去筋膜后經攪拌機攪拌至肉糜狀態。

2.1.2 試材

沙丁胺醇標準品(純度為99.90%，擴展不確定度為U=0.30%，DR公司)，克倫特羅(純度為97.08%，擴展不確定度為U=0.30%，DR公司)標準品，萊克多巴胺標準品(純度為95.00%，擴展不確定度為U=0.71%，DR公司)，內標物質：沙丁胺醇D3，克倫特羅D9，萊克多巴胺D6均為DR公司。高氯酸和氨水(優級純，廣州化學試劑廠)、正己烷(分析純，廣州化學試劑廠)、甲醇和乙腈(色譜純，Fisher chemical)、水為一級水等。陽離子交換柱(安捷倫PCX 3CC 60 mg)，50 mL聚丙烯離心管。

2.2 儀器與設備

液相色譜-串聯質譜儀(安捷倫1290液相-6495串聯質譜儀)，旋渦振蕩器(IKA Vortex 2)，冷凍高速離心機(Sigma 3-18ks)，固相萃取裝置，全自動樣品濃縮儀(Biotage Turbo Vap LV)，感量0.01 mg分析天平(Mettler SEX2505DU)，pH計(Mettler S400-K)等。

2.3 試驗方法

2.3.1 標準溶液配制

分別稱量沙丁胺醇50.05 mg、克倫特羅51.50 mg、萊克多巴胺52.63 mg，用甲醇定容至50 mL，配制成濃度分別為1000 μg/mL標準儲備液。精密吸取100 μL濃度為1000 μg/mL的沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標準儲備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇配制成10.0 μg/mL的混合標準中間液。精密量取100 μL濃度為10.0 μg/mL的沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺混合標準中間液至另一10 mL容量瓶中，用10%甲醇配制成100ng/mL的混合標準中間液。同時將沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺的內標標準品按上法配制成100 ng/mL的混合內標標準中間液。標準溶液均放置于4℃避光保存。用上述濃度為100 ng/mL的混合標準中間液分別稀釋成濃度為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的標準工作溶液，其中內標濃度均為10 ng/mL，待上機測定。

2.3.2 樣品前處理

稱取豬肝2.00 g(精確至0.01 g，6平行樣品)于50 mL聚丙烯離心管，8 mL乙酸銨溶液，加入β-葡萄糖醛酸苷酶40 μL充分旋渦混勻，于37℃水浴酶解16 h，加入100 ng/mL混合內標100 μL，加入100 ng/mL混合標液50 μL，旋渦混勻，高速冷凍(10000 r/min、4℃)離心10 min，將上清液全部轉移至另一50 mL離心管，加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，旋渦混勻，高速冷凍離心10 min，將上清液全部轉移至另一50 mL離心管，用10 mol/L氫氧化鈉調至pH9.3～9.7，加入15 mL乙酸乙酯，放于搖床振搖10 min，高速冷凍離心5 min，將上層有機相全部轉移至另一50 mL離心管，再在下層水相中加入10 mL叔丁基甲醚，放于搖床振搖10 min，高速冷凍離心5 min，合并有機相，在50℃氮氣蒸干，加入5 mL 2%甲酸溶解，待凈化用。

將PCX固相萃取柱依次用3 mL甲醇，3 mL水，3 mL 2%甲酸溶液活化，分次倒入上述待凈化液5 mL過柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL進行淋洗，抽干，棄去淋洗液，用2.5 mL 3%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，在45 ℃下用氮氣蒸干，最后加入1 mL 0.1%甲酸溶液溶解，旋渦混勻1 min，過0.22 μL濾膜，待上機測定。

2.3.3 儀器測定條件

色譜條件：色譜柱為Agilent InfintyLab ProrsheLL 120 EC-C18(2.1×100mm 2.7um)；流動相類型：A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，A+B=98%+2%；梯度洗脫：0～2 min A98%，2～6 min A 98%～65%，6～7 min A 65%～20%，7～8.5 min A 20%～10%，8.5～9 min A 10%～98%；流速0.4 mL/min；運行時間9 min，后運行時間2 min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。質譜條件：電噴霧離子源(AJS-ESI)；正離子掃描；多反應監測模式；干燥氣溫度200 ℃，干燥氣流速14 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min。詳細質譜參數見表1。

表1 3種β受體激動劑及內標的質譜參數

2.3.4 結果計算

計算公式：X=C×V/m。

3 結果分析

3.1 建立數學模型

根據測定方法和結果計算公式, 建立豬肝中3種β受體激動劑殘留測定的數學模型，如式(1)所示。

(1)

式(1)中：X為豬肝樣品中被測物的含量，ug/kg；C為經標準曲線得到的豬肝樣品溶液中被測物的濃度，ng/mL；V為豬肝樣品溶液定容體積，mL；m為試樣的質量，g；A為樣品溶液中被測物的峰面積；Ai為樣品溶液中被測物內標物的峰面積；k為線性回歸方程的斜率；b為回歸方程的截距；R為回收率。

3.2 分析不確定度的來源及量化

根據建立的數學模型，對檢測過程各種不確定度來源進行分析如圖1所示，引入不確定度的主要來源有：被測藥物的濃度C，豬肝樣品的質量m，測量儀器的穩定性，標準溶液的配制過程，定容體積V，方法的重復性，回收率等。內標物在配制成100 ng/mL混合標液之前其濃度保持一致，并不會對樣品中目標物含量的測定造成影響，所以本文僅對100 ng/mL混合標液分取使用過程引入的不確定度進行分析。

圖1 不確定度來源

3.3 計算檢測過程各種不確定度

3.3.1 標準溶液配制引入的不確定度

3.3.1.1 標準品純度含量引入的相對標準不確定度urel(p)

沙丁胺醇標準品的純度p=99.90%，其擴展不確定度為U=0.30%，取擴展因子k=2，其引入的相對標準不確定度為 urel(p沙) = 0.30%÷2÷99.90%=0.0015，urel(p克) =0.30%÷2÷97.08%=0.0016，urel(p萊)=0.71%÷2÷95.00%=0.0038。

3.3.1.2 標準品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

3.3.1.3 標準溶液溶解及稀釋過程引入的相對不確定度

3.3.2 標準曲線擬合引入的相對不確定度

本實驗對沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺制備了6個不同濃度點的標準工作液，每個濃度點測定1次，以目標物峰面積與內標物峰面積的比值(A/Ai)為縱坐標，目標物濃度與內標物濃度的比值(C/Ci)，為橫坐標，采用最小二乘法擬合，各點權重均等，得出目標物的回歸方程，詳見表2。

表2 3種β受體激動劑的回歸方程

根據《JJF 1135-2005》[7]標準曲線擬合引入的標準不確定度，見公式(2)

(2)

由上述計算過程計算得到的藥物的數據見表3。

表3 線性擬合參數類型

3.3.3 樣品稱取引入的相對不確定度urel(m)

3.3.4 定容體積引入的相對標準不確定度urel(V)

3.3.5 檢測儀器引入的相對不確定度

本文所使用的液相色譜串聯質譜儀的校準證書上相對擴展不確定度為Urel=11%，k=2。儀器的相對不確定度urel=11%÷2=0.055。

3.3.6 方法重復性引入的相對標準不確定度urel(rep)

表4 實驗測定6次平行樣品的結果

3.4 計算合成標準不確定度

統計2.3.1至2.3.6過程中不確定度的各個來源，見表5。

表5 不確定度的來源統計

3.5 計算擴展不確定度

合成標準不確定度見表5，u(m)= urel(c)×mg，95%置信水平時，取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×u(m)，則最終沙丁胺醇的測量結果為X=2.49 ug/kg，U=0.48 g/kg，k=2；克倫特羅的測量結果為X=2.52 ug/kg，U=0.56 g/kg，k=2；萊克多巴胺的測量結果為X=2.52 ug/kg，U=0.56 g/kg，k=2。

4 結論

本文評定不確定度影響因素量序大小見表5，結果表明，本實驗中不確定度主要來自于檢測儀器的誤差、標準曲線工作液配制、曲線擬合情況和方法的重復性，與其次是樣品的稱量、儲備液配制和最終定容體積。本文所評定的不確定度主要來源與同行[8-11]評定結果基本一致，證明本文的評定結果準確可靠。在實驗室環境20±5 ℃，器皿校準時溫度與實時溫度差異、甲醇等溶劑的膨脹系數所引入的不確定度遠小于本文所評定的7項，故本文忽略溫度因素。由本實驗中引入不確定度的主要來源進行整改措施，降低整個檢測過程中可能產生的不確定度，減小檢測結果的誤差。改進措施：1、本實驗曲線配制過程引入的不確定度主要是多次使用誤差較大的50 uL、100 uL移液槍檢，應改為在配制工作曲線時直接從100 ng/mL混合標液中吸取到10 mL容量瓶中定容，減少小體積移液槍的使用次數。2、測量儀器狀態不佳帶來較大測定誤差，建議增加日常儀器的維護頻率，對儀器進行定期校準及期間核查等工作，必要時請專業人員進行維修維護，使儀器的穩定性達到最佳狀態。3、本文中3種β受體激動劑的標準曲線的相關系數R2>0.996，經觀察發現其最大濃度點20 ng/mL的峰面積接近線性拐點，舍去該點后線性可達到0.999以上。建議將標準曲線濃度范圍改為0.5～10 ng/mL之間，同時內標液濃度改為5 ng/mL。4、加強檢測技術人員培訓，規范實驗操作，減少人為因素、操作失誤等引入的不確定度。