超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抗生素預(yù)處理方法的優(yōu)化

楊 碩，付曉燕，劉蓮蓮，彭 曉，孫 震

(遼寧省大連生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧 大連 110623)

1 引言

抗生素主要是由細(xì)菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物，可以干擾其他生活細(xì)胞的發(fā)育功能，具有免疫抑制作用，其主要作用是治療細(xì)菌感染或致病微生物感染類疾病，一般不會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。如今，抗生素被廣泛用于醫(yī)療、畜牧等多種行業(yè)。

2011年中國(guó)衛(wèi)生部表示，中國(guó)患者的抗生素使用率為70%，是歐美國(guó)家的兩倍，但真正需要使用的不到20%，由此可見，抗生素濫用情況在我國(guó)乃至世界范圍都非常普遍。抗生素具有一定毒性，由于被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖畜牧業(yè)，后通過食物鏈傳播途徑在人體中不斷積累，人體內(nèi)富集水平逐漸升高，長(zhǎng)期接觸抗生素可以能會(huì)造成惡心嘔吐、食欲不振、昏迷頭暈等不良反應(yīng)，除此之外，抗生素對(duì)人體器官也會(huì)造成不同程度的損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[1]。長(zhǎng)期使用抗生素勢(shì)必會(huì)形成細(xì)菌的耐藥性，易形成超級(jí)細(xì)菌從而對(duì)人類健康更具威脅性。

目前常見的抗生素可分為6種類型，主要包括大環(huán)內(nèi)酯類(MAs)、喹諾酮類(FQs)、磺胺類(SAs)、四環(huán)素類(TCs)、氯霉素類(CPs)和β-內(nèi)酰胺類(β-Lac)[2]。

2 檢測(cè)方法

2.1 預(yù)處理

常見的預(yù)處理方法包括固相萃取法、固相微萃取(SPME)技術(shù)、氣浮溶劑浮選分離/富集技術(shù)、磁性固相萃取法以及冷凍干燥法等。

其中固相萃取法是最常見的預(yù)處理手法，該方法主要利用填充柱對(duì)水樣進(jìn)行萃取，經(jīng)過活化、淋洗、干燥、洗脫以及濃縮等多種前處理步驟，再上樣分析檢測(cè)，固相萃取法操作簡(jiǎn)單方便，吸附容量較大，萃取效率高[3]，回收率高；固相微萃取(SPME)技術(shù)與其他技術(shù)相比，靈敏度較差、準(zhǔn)確度也不高，并且設(shè)備中的纖維缺乏韌性容易破損，僅限于小范圍使用[2]；氣浮溶劑浮選分離/富集技術(shù)中使用的氣浮溶劑毒性大，易對(duì)人體造成傷害，不適合樣品前處理的應(yīng)用；磁性固相萃取法通過對(duì)磁性吸附材料的應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分離，吸附速度快，使用該方法可提高工作效率[4]；冷凍干燥法處理后的樣品，分析時(shí)精密度低，靈敏度差，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于預(yù)處理操作[5]。

2.2 檢測(cè)方法

抗生素的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法、微生物法、氣相色譜法以及酶聯(lián)免疫吸附法。這其中應(yīng)用最廣的是超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法選擇性突出、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均能達(dá)到較高水平，尤其適用于痕量檢測(cè)[3]。

根據(jù)文獻(xiàn)，抗生素相關(guān)研究中大多采用固相萃取法進(jìn)行預(yù)處理分析，再使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)[6]。但該模式也存在一定的局限性，由于抗生素種類繁多，在預(yù)處理?xiàng)l件一致的情況下，不同種類的目標(biāo)物不能全部達(dá)到理想回收率[7]。若按類別單獨(dú)設(shè)置不同預(yù)處理?xiàng)l件，分別檢測(cè)多類抗生素，則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及工作效率無法滿足監(jiān)管或調(diào)查要求。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行完善，比如對(duì)過濾條件、淋洗液、干燥時(shí)間等條件的篩選進(jìn)行優(yōu)化，以此提高超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)多類別抗生素時(shí)的回收率和準(zhǔn)確性。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備分別為：超高效液相色譜儀ACQUITY UPLC；新型離子源加熱型質(zhì)譜儀Waters TQ Detector；全自動(dòng)定量濃縮儀Turbo Vap Ⅱ；自動(dòng)固相萃取儀ASPEC XL4；超純水器Milli-Q；色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm )；固相萃取柱，填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；有機(jī)相針筒式微孔濾膜過濾器，0.22 μm玻璃纖維、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)。

3.2 試劑

實(shí)驗(yàn)中所用試劑情況如下：甲醇HPLC級(jí)(美國(guó)J. T. Baker公司)；甲酸HPLC級(jí)(美國(guó)Sigma公司)；超純水由Milli-Q凈化系統(tǒng)制備后經(jīng)0.22 μm過濾膜所得；氮?dú)狻鍤獾葰怏w純度均≥99.999%；抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)、鹽酸等其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品種類見表1，純度均≥99%(百靈威)。標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1000 mg/L)由甲醇稀釋各標(biāo)準(zhǔn)品分別配制，標(biāo)準(zhǔn)使用液(10 mg/L)由22種抗生素經(jīng)甲醇稀釋混合，于-20 ℃保存。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品種類

3.3 樣品采集與保存

實(shí)驗(yàn)選取大連市6處畜禽養(yǎng)殖地區(qū)的河流斷面地表水進(jìn)行檢測(cè)，涵蓋了大連市所有主要河流。采用1L玻璃棕色瓶采集水樣，加入抗壞血酸溶液作為固定劑，用鹽酸調(diào)節(jié)水樣pH值到2～3左右。樣品采集后加入EDTA 0.25 g，混合均勻。水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，4 ℃避光保存，在24 h內(nèi)盡快進(jìn)行預(yù)處理分析。

3.4 前處理方法

分別用6 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL鹽酸溶液(pH值為2～3)活化小柱，需要特別注意，小柱在活化過程中需一直保持濕潤(rùn)，試劑的流速保持在4 mL/min；取100 mL水樣，以4 mL/min的流速通過填充料，小柱在萃取過程中需一直保持濕潤(rùn)，樣品流速不宜過快，以保證目標(biāo)物回收率；用10 mL的3%甲醇水溶液對(duì)固相萃取柱進(jìn)行淋洗，流速為4 mL/min，淋洗后用真空泵65 kPa負(fù)壓抽干，再用氮?dú)飧稍?5 min；用12 mL甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行洗脫，流速為4 mL/min，洗脫液收集于氮吹管中；在35 ℃下，利用全自動(dòng)定量濃縮儀將洗脫液濃縮至0.5 mL，再用0.1%甲酸溶液將其定容到1.0 mL；經(jīng)0.22 μm濾膜過濾裝入進(jìn)樣瓶，以備上機(jī)分析。

4 結(jié)果與討論

4.1 過濾條件的優(yōu)化

在樣品采集過程中，采集1000 mL水樣后加入固定劑抗壞血酸溶液，并調(diào)節(jié)水樣pH值到2～3左右，再加入EDTA 0.25 g，混合水樣。在水樣未經(jīng)0.45 μm濾膜過濾時(shí)進(jìn)行萃取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未經(jīng)過濾的樣品直接上柱進(jìn)行固相萃取，容易被水樣種大顆粒雜質(zhì)污染固相萃取柱，導(dǎo)致填充材料阻塞萃取耗時(shí)過長(zhǎng)，效率極低。在實(shí)行上述加固定劑、調(diào)節(jié)pH值等相同條件后，水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾萃取，萃取時(shí)長(zhǎng)縮短為未經(jīng)過濾水樣的1/4左右。

4.2 淋洗液的優(yōu)化

水樣中的目標(biāo)物經(jīng)過填充柱后，需要經(jīng)過淋洗以去除雜質(zhì)，提升目標(biāo)物純度。實(shí)驗(yàn)中在其他條件保持一致時(shí)，分別使用超純水、3%甲醇水溶液作為淋洗液對(duì)填充柱進(jìn)行淋洗后，在進(jìn)行干燥、洗脫、濃縮、檢測(cè)分析得出，當(dāng)使用3%甲醇水溶液作為淋洗液時(shí)，多種抗生素回收率明顯較高。所以在預(yù)處理過程中選擇3%甲醇水溶液進(jìn)行淋洗。

4.3 干燥時(shí)長(zhǎng)的優(yōu)化

目標(biāo)物由水樣轉(zhuǎn)移至填料，富集過程后需要對(duì)填料進(jìn)行干燥處理，由于填充柱中殘留的水分對(duì)于氮吹濃縮步驟時(shí)長(zhǎng)有很大影響，因此也會(huì)影響抗生素檢測(cè)回收率。實(shí)驗(yàn)中在其他條件保持一致時(shí)，分別設(shè)置干燥時(shí)長(zhǎng)為5 min、15 min以及30 min，用氮?dú)鈱?duì)填充柱進(jìn)行干燥處理。發(fā)現(xiàn)將干燥時(shí)長(zhǎng)為15 min時(shí)，多種抗生素回收率最高，尤其對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類這兩大類，回收效果顯著高于另外兩種干燥時(shí)長(zhǎng)。所以在預(yù)處理是選擇干燥15 min之后再進(jìn)行其他步驟。

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)使用超高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)6個(gè)地表水點(diǎn)位中14種抗生素進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，結(jié)果表明，若將過濾條件設(shè)定為水樣需經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，選擇3%甲醇水溶液作為淋洗液對(duì)填充柱進(jìn)行淋洗，將填料進(jìn)行干燥處理時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為15 min，則能夠?qū)?4種抗生素實(shí)現(xiàn)有效分離測(cè)定，分析高效快速，準(zhǔn)確性靈敏度高。該方法也可應(yīng)用于其他類型地表水及地下水中抗生素的檢測(cè)，尤其對(duì)于痕量殘留目標(biāo)物的檢測(cè)準(zhǔn)確有效，為水污染防治大計(jì)提供了技術(shù)支持與數(shù)據(jù)支撐。