超高效液相色譜-串聯質譜法測定抗生素預處理方法的優化

楊 碩，付曉燕，劉蓮蓮，彭 曉，孫 震

(遼寧省大連生態環境監測中心，遼寧 大連 110623)

1 引言

抗生素主要是由細菌、霉菌或其他微生物產生的次級代謝產物或人工合成的類似物，可以干擾其他生活細胞的發育功能，具有免疫抑制作用，其主要作用是治療細菌感染或致病微生物感染類疾病，一般不會對宿主產生嚴重的副作用。如今，抗生素被廣泛用于醫療、畜牧等多種行業。

2011年中國衛生部表示，中國患者的抗生素使用率為70%，是歐美國家的兩倍，但真正需要使用的不到20%，由此可見，抗生素濫用情況在我國乃至世界范圍都非常普遍。抗生素具有一定毒性，由于被廣泛應用于養殖畜牧業，后通過食物鏈傳播途徑在人體中不斷積累，人體內富集水平逐漸升高，長期接觸抗生素可以能會造成惡心嘔吐、食欲不振、昏迷頭暈等不良反應，除此之外，抗生素對人體器官也會造成不同程度的損傷，導致多種疾病的發生[1]。長期使用抗生素勢必會形成細菌的耐藥性，易形成超級細菌從而對人類健康更具威脅性。

目前常見的抗生素可分為6種類型，主要包括大環內酯類(MAs)、喹諾酮類(FQs)、磺胺類(SAs)、四環素類(TCs)、氯霉素類(CPs)和β-內酰胺類(β-Lac)[2]。

2 檢測方法

2.1 預處理

常見的預處理方法包括固相萃取法、固相微萃取(SPME)技術、氣浮溶劑浮選分離/富集技術、磁性固相萃取法以及冷凍干燥法等。

其中固相萃取法是最常見的預處理手法，該方法主要利用填充柱對水樣進行萃取，經過活化、淋洗、干燥、洗脫以及濃縮等多種前處理步驟，再上樣分析檢測，固相萃取法操作簡單方便，吸附容量較大，萃取效率高[3]，回收率高；固相微萃取(SPME)技術與其他技術相比，靈敏度較差、準確度也不高，并且設備中的纖維缺乏韌性容易破損，僅限于小范圍使用[2]；氣浮溶劑浮選分離/富集技術中使用的氣浮溶劑毒性大，易對人體造成傷害，不適合樣品前處理的應用；磁性固相萃取法通過對磁性吸附材料的應用，可以實現對目標物的分離，吸附速度快，使用該方法可提高工作效率[4]；冷凍干燥法處理后的樣品，分析時精密度低，靈敏度差，且費時費力，不適于預處理操作[5]。

2.2 檢測方法

抗生素的檢測方法主要包括液相色譜法、微生物法、氣相色譜法以及酶聯免疫吸附法。這其中應用最廣的是超高效液相色譜-串聯質譜法，該方法選擇性突出、靈敏度、準確度、精密度均能達到較高水平，尤其適用于痕量檢測[3]。

根據文獻，抗生素相關研究中大多采用固相萃取法進行預處理分析，再使用超高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測[6]。但該模式也存在一定的局限性，由于抗生素種類繁多，在預處理條件一致的情況下，不同種類的目標物不能全部達到理想回收率[7]。若按類別單獨設置不同預處理條件，分別檢測多類抗生素，則費時費力，數據準確性及工作效率無法滿足監管或調查要求。因此，本實驗對預處理條件進行完善，比如對過濾條件、淋洗液、干燥時間等條件的篩選進行優化，以此提高超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測多類別抗生素時的回收率和準確性。

3 實驗部分

3.1 儀器與設備

實驗中使用的設備分別為：超高效液相色譜儀ACQUITY UPLC；新型離子源加熱型質譜儀Waters TQ Detector；全自動定量濃縮儀Turbo Vap Ⅱ；自動固相萃取儀ASPEC XL4；超純水器Milli-Q；色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm )；固相萃取柱，填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；有機相針筒式微孔濾膜過濾器，0.22 μm玻璃纖維、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)。

3.2 試劑

實驗中所用試劑情況如下：甲醇HPLC級(美國J. T. Baker公司)；甲酸HPLC級(美國Sigma公司)；超純水由Milli-Q凈化系統制備后經0.22 μm過濾膜所得；氮氣、氬氣等氣體純度均≥99.999%；抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)、鹽酸等其他試劑均為分析純。實驗中標準品種類見表1，純度均≥99%(百靈威)。標準貯備液(1000 mg/L)由甲醇稀釋各標準品分別配制，標準使用液(10 mg/L)由22種抗生素經甲醇稀釋混合，于-20 ℃保存。

表1 標準品種類

3.3 樣品采集與保存

實驗選取大連市6處畜禽養殖地區的河流斷面地表水進行檢測，涵蓋了大連市所有主要河流。采用1L玻璃棕色瓶采集水樣，加入抗壞血酸溶液作為固定劑，用鹽酸調節水樣pH值到2～3左右。樣品采集后加入EDTA 0.25 g，混合均勻。水樣經0.45 μm濾膜過濾，4 ℃避光保存，在24 h內盡快進行預處理分析。

3.4 前處理方法

分別用6 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL鹽酸溶液(pH值為2～3)活化小柱，需要特別注意，小柱在活化過程中需一直保持濕潤，試劑的流速保持在4 mL/min；取100 mL水樣，以4 mL/min的流速通過填充料，小柱在萃取過程中需一直保持濕潤，樣品流速不宜過快，以保證目標物回收率；用10 mL的3%甲醇水溶液對固相萃取柱進行淋洗，流速為4 mL/min，淋洗后用真空泵65 kPa負壓抽干，再用氮氣干燥15 min；用12 mL甲醇對固相萃取柱進行洗脫，流速為4 mL/min，洗脫液收集于氮吹管中；在35 ℃下，利用全自動定量濃縮儀將洗脫液濃縮至0.5 mL，再用0.1%甲酸溶液將其定容到1.0 mL；經0.22 μm濾膜過濾裝入進樣瓶，以備上機分析。

4 結果與討論

4.1 過濾條件的優化

在樣品采集過程中，采集1000 mL水樣后加入固定劑抗壞血酸溶液，并調節水樣pH值到2～3左右，再加入EDTA 0.25 g，混合水樣。在水樣未經0.45 μm濾膜過濾時進行萃取，實驗結果表明未經過濾的樣品直接上柱進行固相萃取，容易被水樣種大顆粒雜質污染固相萃取柱，導致填充材料阻塞萃取耗時過長，效率極低。在實行上述加固定劑、調節pH值等相同條件后，水樣經0.45 μm濾膜過濾萃取，萃取時長縮短為未經過濾水樣的1/4左右。

4.2 淋洗液的優化

水樣中的目標物經過填充柱后，需要經過淋洗以去除雜質，提升目標物純度。實驗中在其他條件保持一致時，分別使用超純水、3%甲醇水溶液作為淋洗液對填充柱進行淋洗后，在進行干燥、洗脫、濃縮、檢測分析得出，當使用3%甲醇水溶液作為淋洗液時，多種抗生素回收率明顯較高。所以在預處理過程中選擇3%甲醇水溶液進行淋洗。

4.3 干燥時長的優化

目標物由水樣轉移至填料，富集過程后需要對填料進行干燥處理，由于填充柱中殘留的水分對于氮吹濃縮步驟時長有很大影響，因此也會影響抗生素檢測回收率。實驗中在其他條件保持一致時，分別設置干燥時長為5 min、15 min以及30 min，用氮氣對填充柱進行干燥處理。發現將干燥時長為15 min時，多種抗生素回收率最高，尤其對于大環內酯類和喹諾酮類這兩大類，回收效果顯著高于另外兩種干燥時長。所以在預處理是選擇干燥15 min之后再進行其他步驟。

5 結論

實驗使用超高效液相色譜-質譜法對6個地表水點位中14種抗生素進行檢測。通過對預處理條件進行篩選和優化，結果表明，若將過濾條件設定為水樣需經0.45 μm濾膜過濾，選擇3%甲醇水溶液作為淋洗液對填充柱進行淋洗，將填料進行干燥處理時長設定為15 min，則能夠對14種抗生素實現有效分離測定，分析高效快速，準確性靈敏度高。該方法也可應用于其他類型地表水及地下水中抗生素的檢測，尤其對于痕量殘留目標物的檢測準確有效，為水污染防治大計提供了技術支持與數據支撐。